黑木耳降血脂酸性多糖提取及初步纯化的研究

刘荣，程萍，栾淑莹，赵影，王振宇

（1.东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨150040；2.哈尔滨工业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150090）

黑木耳降血脂酸性多糖提取及初步纯化的研究

刘荣1，程萍1，栾淑莹1，赵影1，王振宇2，*

（1.东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨150040；2.哈尔滨工业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150090）

为优化黑木耳降血脂酸性多糖的提取工艺，应用单因素试验和响应面分析法进行研究。选择料液比、提取温度、提取时间为主要影响因素，黑木耳多糖的得率（Y1）和与牛磺胆酸钠（STC）结合率（Y2）为响应值，进行多个指标同步优化。获得最佳提取工艺参数为：pH为9.0、料液比为1∶80（g/mL）、提取温度为71.5℃、提取时间为2.0 h。在此最佳条件下，多糖得率为3.25%，STC结合率为19.95%。采用弱碱性的大孔阴离子交换树脂D315对该多糖进行初步纯化，有效地对多糖进行脱色和脱蛋白处理，提高多糖纯度，减少多糖活性成分降解，为黑木耳酸性多糖的进一步开发利用提供理论参考。

黑木耳酸性多糖；降血脂；响应面；D315树脂

高血脂症是指人体中脂质代谢不正常，血浆里的脂质包括甘油三脂、胆固醇等组分的含量超过正常范围的病症，主要诱发动脉粥样硬化、冠心病等疾病［1］。有研究结果显示降低血浆内胆固醇含量可减少冠心病得突发［2］。因此监测人体内胆固醇含量具有重要意义。体内胆固醇降解的主要途径是通过胆管系统将胆汁酸排出体外［3］。有研究表明多种植物的多糖类物质对胆酸盐具有吸附作用，因此可以通过测定游离胆酸盐的含量间接得出胆固醇减少的量，进而表明降血脂的作用效果［2］。

黑木耳多糖是一种重要的生物活性成分。许多研究显示，黑木耳多糖具有预防肿瘤、抗凝血和血栓、降低血糖和血脂等生物活性［4］。不同提取分离方法对黑木耳多糖的得率、纯度和生物活性有很大影响。黑木耳多糖的提取方法主要包括热水浸提、稀碱浸提法，同时辅以超声波、微波等多种技术［5］，多糖的活性结构容易遭破坏。同时黑木耳多糖脱色及除蛋白经常采用化学方法，但容易破坏多糖结构，降低多糖活性。

D315树脂为大孔弱碱性阴离子交换树脂，用其进行脱色的同时，还可以吸附酸性多糖［6］。因此本试验旨在结合黑木耳多糖降血脂这一生理功能，优化降血脂酸性多糖的提取条件，并用大孔阴离子交换树脂D315进行初步纯化，拟在找出黑木耳降血脂酸性多糖最佳的提取条件和纯化工艺，为黑木耳多糖的进一步开发利用提供理论基础。

1　材料与方法

1.1原料

黑木耳：市售，产自哈尔滨，经除杂、干燥、粉碎，过60目筛，采用石油醚进行脱脂24 h，干燥保存。

1.2试剂与仪器

1.2.1主要试剂

葡萄糖、苯酚、浓硫酸、氯化钠、氢氧化钠、无水乙醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等试剂均为国产分析纯；胃蛋白酶（1∶30 000 U）、胰蛋白酶（1∶250 U）：上海源叶生物科技有限公司；牛磺胆酸钠：西亚试剂。

1.2.2主要仪器

722可见分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司；R-205B旋转蒸发仪：上海申胜仪器公司；DK-8D型电热恒温水槽：上海一恒科技有限公司；DHG-9240电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司；XW-80A漩涡混合器：江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.3方法

1.3.1黑木耳酸性多糖的提取工艺

原料→提取→3 000 r/min离心→过滤→合并上清液→浓缩→透析24 h→用3倍体积95%乙醇沉淀→离心→真空抽滤去除残留乙醇→烘干→粗多糖

1.3.2粗多糖得率的测定

采用苯酚-硫酸法［7］。准确称取0.1 g的粗多糖用蒸馏水复溶，配制成100 mL多糖溶液，稀释100倍，取2 mL，加入6%的苯酚1.0 mL及浓硫酸5.0 mL，静置10 min，摇匀后室温放置20 min后于490 nm下测OD值，计算多糖含量以及粗多糖得率。

1.3.3粗多糖与牛磺胆酸钠的测定

胆固醇转化为胆汁酸在肝脏中主要是以盐的形式存在，其中可与牛磺胆酸形成牛磺胆酸钠（STC），因此可以通过测定样品对牛磺胆酸钠的结合能力间接表明其降血脂能力。

牛磺胆酸钠（STC）标准曲线的制作［8］（略作修改）：取2.0 mL各不同浓度标准溶液于具塞试管中，加入6 mL 60%的硫酸，于70℃水浴20 min，冷却5 min，于387 nm波长处测定吸光度。以吸光值（y）为纵坐标，浓度（x）为横坐标，绘制标准曲线。标准曲线的回归方程为y=2.010 3x+0.074 9（R2=0.999 3），式中：y为吸光度；x为牛磺胆酸钠浓度，单位：μmol/mL。

粗多糖结合STC能力（W）的测定方法参照文献［9］，其结合率计算公式为：

式中：n1为空白样上清液中的牛磺酸胆酸钠浓度，mmol/L；n2为多糖样品上清液中的牛磺酸胆酸钠浓度，mmol/L。

1.3.4单因素试验

选取pH、时间、料液比、提取温度为主要影响因素，以黑木耳酸性多糖得率和STC结合率为考虑指标，进行单因素试验。其中pH选取7.0、8.0、9.0、10.0、11.0五个水平；料液比选取1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90（g/mL）五个水平；提取温度选取60、70、80、90、100℃五个水平；提取时间选取1、2、3、4、5 h 5个水平。

1.3.5响应面试验设计

由于目标产物为酸性多糖，因此响应面试验固定多糖提取液的pH。采用Box-Behnken试验方法进行三因素三水平试验，以得率和STC结合率为响应值进行响应面分析。3个因素分别为料液比、温度、时间，分别编码为A、B、C，并以+1、0、-1分别代表变量的水平。综合考虑后以多糖与STC结合率为主要响应值，对各因素的设计水平如表1所示。

表1　优化试验因素水平表Table 1　Factors and levels in CCD

1.3.6D315树脂初步纯化降血脂酸性多糖

1.3.6.1初步纯化降血脂酸性多糖

将预处理好的D315树脂湿法上柱（柱高40 cm，柱体积200 cm3），吸取上述1.3.2项下供试品多糖溶液70 mL缓缓加入层析柱中，吸附4 h后，先用蒸馏水洗脱，再用0.1 mol/L NaCl溶液洗脱剩余多糖成分，洗脱液透析脱盐，醇沉烘干待用。

1.3.6.2纯化后多糖理化指标测定

1）纯度测定

准确称取50 mg初步纯化后的多糖复溶于50 mL容量瓶中，测定多糖含量，计算纯度。

2）蛋白质含量测定：考马斯亮兰法［10］。

3）脱色率测定：分别取纯化前和纯化后的多糖溶液在420 nm处测其OD值［11］。

2　结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1pH对黑木耳降脂多糖提取的影响

图1为提取温度为60℃、提取时间为3 h、提取料液比为1∶60（g/mL）时，不同pH对黑木耳多糖得率（Y1）及与STC结合能力（Y2）的影响。

图1　pH对黑木耳降酯多糖和STC结合能力的影响Fig.1　Effect of pH on Y1and Y2

由图1可知pH在7.0到9.0之间，多糖得率增加缓慢；在pH=10.0时，多糖得率达到最大，但随后多糖得率下降，可能是碱性太强使黑木耳中某些杂质溶出度增加，使得多糖得率下降。pH在7.0到11.0之间多糖与STC结合能力变化比较明显，呈现先上升后下降的趋势，可能是由于随着提取液碱性的增强破坏了多糖结构，因此在pH=9.0时与STC结合能力达到最大值。综合两者，为了能获得较多降脂多糖，因此pH选择9.0。

2.1.2料液比对黑木耳降脂酸性多糖提取的影响

图2为提取温度为60℃、提取时间为3 h、提取液pH=9.0时，不同料液比对黑木耳多糖得率及与STC结合能力的影响。

图2　料液比对黑木耳降酯多糖和STC结合能力的影响Fig.2　Effect of liquid-solid ratio on Y1and Y2

由图2可知，随着料液比的增加，多糖得率呈现先提高后下降的趋势，在1∶80（g/mL）时得率达到最大值；降脂多糖与STC的结合能力也呈现相似趋势，先迅速增加后下降，在1∶80（g/mL）处结合能力达到最大。综合两者可知，料液比选择1∶80（g/mL）为宜。

2.1.3提取温度对黑木耳降脂酸性多糖提取的影响

图3为提取时间为3 h、料液比为1∶80（g/mL）、提取液pH=9.0时，不同提取温度对黑木耳多糖得率及与STC结合能力的影响。

图3　提取温度对黑木耳降酯多糖的影响Fig.3　Effect of extraction temperature on Y1and Y2

由图3可知，多糖得率随着温度的升高而增加，在60℃到90℃之间缓慢增加，在100℃时得率达到最大；降脂多糖与STC结合率随着提取温度的升高呈现先上升后下降的趋势，在70℃时结合率达到最大值，且在80℃到100℃之间缓慢下降，出现这种现象可能是由于温度升高导致多糖结构被破坏。综合两者比较，为了获得较多的稳定结构的降脂多糖，故提取温度选择70℃。

2.1.4提取时间对黑木耳降脂酸性多糖提取的影响

图4为料液比为1∶80（g/mL）、提取温度为70℃、提取液pH=9.0时，不同提取时间对黑木耳多糖得率及与STC结合能力的影响。

由图4可知，随着提取时间的增加多糖得率有所增加，在3 h达到最大值，3 h后曲线趋于平缓；降脂多糖与STC结合率随着提取时间的增加呈现先上升后下降的趋势，在2 h时结合能力达到最优，出现这种现象可能是由于时间过长，多糖物质在加热及搅拌的共同作用下发生断裂，影响与STC的结合。综合比较，提取时间选择2 h。

图4　提取时间对黑木耳降酯多糖的影响Fig.4　Effect of extraction time on Y1and Y2

2.2响应面试验结果

2.2.1响应面试验设计及结果

根据软件设计的试验方案，需做17组试验来优化3个因素，结果见表2所示。

表2　Box-Behnken响应面实验设计方案及结果Table 2　Results of the response surface by Box-Behnken

2.2.2得率模型及方差分析

根据试验结果获得的二次回归数学模型为：

式中：Y1表示降脂酸性多糖的得率；A表示料液比，g/mL；B表示提取温度，℃；C表示提取时间，h。

通过回归方差分析确定模型的拟合度，结果见表3所示。

由表3可知，模型的P＜0.000 1，表明这个二次回归模型显著；二次回归模型的线性相关（R2）为0.979 5，表明97.95%的可能可以由这个拟合模型表示；而R2adj为0.953 1，表明只有4.69%的可能性不符合这个模型，也说明预测值和试验值的高度相关；C.V.值越小，表明试验数据越可靠，表中C.V.%=2.37表明试验数据具有较好的可靠性。失拟项的P=0.993 4，表明这一项不显著，模型是适合的。同时，由F值的大小可以推断，在所选择的试验范围内，3个因素对多糖得率影响大小的排序为提取温度（B）>提取时间（C）>料液比（A）。

表3　降脂酸性多糖得率的回归方差分析Table 3　Variance analysis of the regression equation for Y1

2.2.3STC结合率模型及方差分析根据Box-Behnken软件建立的二次回归模型为：

式中：Y2为STC结合率，%；A为料液比，（g/mL）；B为提取温度，℃；C为提取时间，h。

黑木耳降血脂酸性多糖与STC结合能力模型回归方差分析见表4所示。

表4　降脂酸性多糖与STC结合能力的回归方差分析Table 4　Variance analysis of the regression equation for Y2

续表4　降脂酸性多糖与STC结合能力的回归方差分析Continue table 4　Variance analysis of the regression equation for Y2

由表4可知模型的P＜0.000 1，表明这个二次回归模型显著；失拟项P=0.081 1，表明这一项不显著。因而该模型的拟合度比较好，可用此模型对提取的黑木耳降血脂多糖与STC结合能力进行预测和分析。同时，由F值的大小可以推断，在所选择的试验范围内，3个因素对多糖与STC结合率影响大小的排序为提取时间（C）>提取温度（B）>料液比（A）。

2.2.4因素间的交互作用对响应值的影响分析

图5　各因素对多糖得率和多糖与STC结合率的影响的响应值Fig.5　Response surface plots showing the effect of factors on Y1and Y2

图5为模型的的三维响应图，从图中可以直观地看出各因素之间的交互作用对响应值的影响。由三维图可知，在所选范围内存在最大值，即响应面最高点。在图a中，提取温度和料液比相互作用显著，多糖得率都是随着二者的增加先迅速升高后趋于缓慢。图b中，随着料液比和提取时间的增加，多糖的得率不断升高，说明在此范围内，提取时间和料液比对多糖得率作用显著。图c显示的是提取时间和温度对多糖得率的影响，图中显示二者对多糖得率作用显著。图d显示的是提取温度和料液比对多糖与STC结合率的影响，随着二者的增加，STC结合率呈现先升高后下降的趋势。图e显示的是提取时间和料液比对多糖与STC结合率的影响，从图中可以看出，提取时间过长、料液比越大，多糖与STC结合率越低，说明酸性多糖活性降低。图f显示时间和温度对多糖与STC结合率的影响，从中可以看出，提取时间过长、提取温度过大，多糖与STC结合率越低，说明多糖活性损失越多。

综合多糖得率与多糖与STC结合率这两个指标可以得出，由响应面预测模型预测的最佳提取黑木耳酸性多糖的条件为：pH为9.0、料液比为1∶80.39（g/mL）、提取温度为71.46℃、提取时间为2.04 h。预测多糖得率为3.21%，多糖与STC结合率为20.00%。

2.2.5预测模型的验证

根据最优的工艺参数，再结合设备的限制条件，响应面模型预测的最优条件修改为：pH为9.0、料液比为1∶80（g/mL）、提取温度为71.5℃、提取时间为2.0 h。结果显示黑木耳酸性多糖得率的实测值为3.25%，预测值为3.23%；与STC结合率实测值为19.95%，预测值为19.98%。预测值与实测值非常接近，偏差较小，表明这个模型和响应曲面法来优化提取工艺是可行的。

2.3D315树脂初步纯化结果

用弱碱性的大孔阴离子交换树脂D315初步纯化黑木耳酸性多糖结果见表5所示。

表5　初步纯化结果Table 5　Result of preliminary purification %

由表5可知，黑木耳酸性多糖经D315树脂处理后，蛋白质清除率和脱色率都接近于80%，提高了多糖纯度且降血脂活性没有遭到破坏。因此弱碱性的大孔阴离子交换树脂D315不仅可以对黑木耳酸性多糖有效地进行脱色和脱蛋白处理，提高多糖纯度，同时还可以较大程度的保留酸性多糖的活性成分，对黑木耳多糖进行初步纯化。

3　结论

本试验在单因素试验的基础上，通过Box-Benhnken的响应面法建立了3个影响因素（液料比、提取时间、提取温度）与两个响应值（多糖得率、降血脂活性）相互作用的数学模型，得出黑木耳降血脂酸性多糖的最佳提取工艺参数为pH为9.0、料液比为1∶80（g/mL）、提取温度为71.5℃、提取时间为2.0 h。多糖得率为3.25%，STC结合率为19.95%。为了提高降血脂活性，采用单一热稀碱浸提黑木耳酸性多糖，得率不是非常高。同时为了减少多糖的降解，采用较温和的大孔树脂吸附法除去多糖的蛋白质和色素等物质，进行初步纯化。这些研究能够帮助我们有效的控制提取工艺条件，保护降血脂活性物质，减少多糖的降解，并对工业化生产提供一些借鉴，为进一步研究黑木耳酸性多糖的分子组成、分子结构以及其降血糖的功能活性提供理论基础。

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Study on Extraction and Preliminary Purification of Auricularia Acidic Polysaccharide with Reducing Blood Lipid

LIU Rong1，CHENG Ping1，LUAN Shu-ying1，ZHAO Ying1，WANG Zhen-yu2，*
（1.College of Forestry，Northeast Forest University，Harbin 150040，Heilongjiang，China；2.Department of Food Science and Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，Heilongjiang，China）

To study the optimal extraction technology of auricularia acidic polysaccharide with reducing blood lipid，the single factor experiment was utilized combined with response surface methodology.The experimental datas were fitted to create two mathematical models describing yield（Y1）and in vitro binding of STC（Y2）obtained at different levels of critical factors，such as extraction temperature and time and material/liquid ratio. The optimum extraction conditions were as follows：pH 9.0，material to water ratio 1∶80（g/mL），extraction temperature 71.5℃，extraction time 2.0 h.Under these conditions，the yield of polysaccharide was 3.25%，the binding of STC was 19.95%.Weak base macroporous anion-exchange resin D315 was used for preliminary purification.The treatment had the effect on discoloration and deproteinized，improveing polysaccharide purity，reducing the degradation of the active ingredient.These can provide a theoretical basis for the further development and utilization of auricularia acidic polysaccharide.

auricularia acidic polysaccharide；reducing blood lipid；response surface；resin D315

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.21.009

黑龙江省应用技术研究与开发技术项目“黑木耳即食产品开发关键技术研究”（GA13B202）

刘荣（1971—），女（汉），副研究员，硕士生导师，博士，主要从事食品营养学与功能性食品研究。

2016-01-05