酶法制备青钱柳茶汤的工艺研究

黄瑶，高年芬，谭俊呈，易弋，陈洁，黄建星，陈振坤

（1.广西科技大学生物与化学工程学院，广西柳州545006；2.柳州市青钱柳农业科技开发有限公司，广西柳州545006）

酶法制备青钱柳茶汤的工艺研究

黄瑶1，高年芬1，谭俊呈2，易弋1，陈洁1，黄建星2，陈振坤2

（1.广西科技大学生物与化学工程学院，广西柳州545006；2.柳州市青钱柳农业科技开发有限公司，广西柳州545006）

为了探索制备青钱柳茶汤的新工艺新方法，利用双酶（纤维素酶∶果胶酶=2∶1，m／m）水解法对青钱柳的茶汤制备条件进行研究.结果表明，青钱柳茶汤制备工艺最优条件为：双酶添加量为1.5％（m／v），反应温度70℃，反应时间140min，反应pH值5.0.此条件下青钱柳茶汤中茶多酚的提取率为4.33％，游离氨基酸总量的提取率为4.64％.双酶水解法制备茶汤可以获得较理想的提取效果，为青钱柳茶的市场开发提供科学的参考依据.

青钱柳茶；纤维素酶和果胶酶；茶多酚；游离氨基酸

0　引言

青钱柳（Cyclocaryapaliurus（Bata1.）Iljinskaja）又名青钱李、摇钱树等，是一种高大速生乔木，奇数羽状复叶，系胡桃科青钱柳属植物，是中国特有的单种属植物，也是国家重点保护的濒危植物之一.青钱柳产于长江以南，多生于海拔420m～2 500m的山区、溪谷、林缘、林内或石灰岩山地，主要分布于安徽、江西、江苏、浙江、台湾、湖北、湖南、四川、贵州、广西、广东和云南等地.现有的青钱柳资源主要是天然林，为了加大青钱柳的应用和产业化进程，20世纪80年代以来一直有研究人员对其人工栽培的有性繁殖和无性繁殖方法进行探索，并取得了提高出苗率和提高扦插成活率等成果.青钱柳树叶泡出的茶汤甘甜滋润，生津止渴，被认为具有清热解暑、防病治病等功效，故又被老百姓称为“甜茶”、“神茶”［1］.研究表明，青钱柳叶含有丰富的化学成分如黄酮类、多糖、酚酸类以及多种矿物质和氨基酸等，具有降血糖、降血压、降血脂和增强免疫力等功效［2-6］.

目前，青钱柳开发的保健产品主要以制茶为主.有研究表明纤维素酶和果胶酶能促进茶叶的提取率，提高茶叶的利用率［7］.利用酶法制备的茶汤不但可以很大程度的留存了茶叶中的活性成分，而且还能够获得更好的风味，更有益身体健康.采用复合酶解法可以有效提高茶汤中的茶多酚、咖啡碱和茶多糖的含量［8］.本研究利用纤维素酶和果胶酶复合使用的双酶法制备青钱柳茶汤，因为茶多酚和氨基酸在茶汤中是主要的营养物质和生物活性成分，所以本研究以茶多酚和游离氨基酸含量为指标，研究青钱柳茶汤的最佳制备工艺，为青钱柳茶的市场开发提供科学的参考依据.

1　材料和方法

1．1材料

青钱柳叶：由柳州市青钱柳农业科技开发有限公司提供，采于广西柳州三江县，鲜叶晒干成生茶叶.纤维素酶、果胶酶：BR，产于上海如吉生物科技发展有限公司，添加时按质量比（m／m）纤维素酶∶果胶酶=2∶1复合使用［9］.

1．2方法

1.2.1单因素条件筛选

准确称量青钱柳生茶叶1．0 g放入50mL锥形瓶中，添加复合酶，在不同梯度的茶水比、酶用量、反应温度、反应时间、反应pH值的试验条件下进行酶解反应后，90℃使酶失活15min，过滤，3 500 r／min离心10min，取上清液检测不同条件下提取液中茶多酚和游离氨基酸提取率，进行单因素条件筛选．

1．2．2测定方法

1．2．2．1茶多酚的测定：酒石酸亚铁比色法［10］；

分别吸取1mL样液放入25mL的比色管中，依次添加蒸馏水4mL和酒石酸亚铁溶液5mL，充分混匀，用pH 7．5磷酸缓冲液定容到25mL，用10mm比色杯，在波长540 nm处，以蒸馏水为空白溶液作参比，测定吸光度（A1）．同时吸取相等的样液放入25mL的比色管中，添加蒸馏水4mL，用pH 7．5磷酸缓冲液定容至25mL，用10mm比色杯，在波长540 nm处，以蒸馏水为空白溶液作参比，测定吸光度（A2）．

1．2．2．2游离氨基酸总量的测定：茚三酮比色法［11］．

标准曲线的绘制：分别移取浓度不同的氨基酸溶液1．0mL放入25mL的具塞比色管中，分别依次添加pH值8．0的磷酸盐缓冲液0．5mL和2％浓度的茚三酮溶液0．5mL，于沸水浴中加热15min．冷却至室温后添加水定容至25mL，静置10min后，用10mm比色皿，在波长560 nm处测定吸光度，绘制标准曲线．

正是因为这个原因，外圆内方的全新一代路虎发现在刚刚推出的时候于设计方面迎来了很大的争议。其实观点的争议并不可怕，无数经典的例子告诉我们，认知的不同的确能够成就情节跌宕的故事并塑造出一个个独立且鲜活的个体。这辆路虎发现显然能够用设计中的“圆”拥抱和以往不同的支持者，并用性格里的“方”再次启发人们心中对经典的认知。

样品的测定：准确移取样液1mL放入25mL的具塞比色管中，添加pH值8．0的磷酸盐缓冲液0．5mL和浓度为2％的茚三酮溶液0．5mL，于沸水浴中加热15min．待冷却至室温后加蒸馏水定容到25mL．静置10min后，用10mm比色皿，在波长为560 nm处，以试剂空白溶液作参考比值，测定其吸光度，根据氨基酸标准曲线的公式求出溶液中氨基酸的含量．

1．2．3提取率的计算［9］

式（1）中：L——稀释倍数；C——标准曲线上得到的游离氨基酸含量；M——样品质量，g．

式（2）中：A1——样品显色后吸光度；A2——样品底色吸光度；L——稀释倍数；M——样品质量，g；1．957——在540 nm波长下，10mm比色杯，吸光度为0．5时，1mL茶样液中茶多酚的含有量等于1．957mg．

2　结果和分析

2．1游离氨基酸标准曲线的制备

以吸光度（OD值）为纵坐标，茶氨酸含量为横坐标绘制游离氨基酸总量标准曲线见图1．得回归直线方程为y＝0．636 57x－0．245 53（y——吸光度，x——质量浓度，mg／mL），R2＝0．998 52．

2．2茶水比对提取效果的影响

青钱柳茶水比（m／v）分别设置为1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35等6个不同梯度，其他酶解条件设定为复合酶添加量0．9％（m／v），水解温度70℃，水解时间50min，pH值5．0进行试验，测定茶汤中的茶多酚、游离氨基酸总量的提取率，结果见图2和图3．

由图2、图3可知：随着茶水比例的变化，茶多酚的提取率和游离氨基酸总量的提取率呈下降趋势，当茶水比为1∶10时提取率最高，茶多酚和游离氨基酸总量的提取率分别为3．34％和4．44％，说明溶剂的增加对于茶多酚和游离氨基酸的浸出没有起到作用，并由于稀释作用而使溶质的含量下降；因此，选择1∶10为最佳茶水比．

图1　游离氨基酸总量标准曲线Fig．1 Standard curve of total free amino acid

图2　茶水比对茶多酚提取率的影响Fig.2 Effect of tea-leaves and liquid proportion on extraction ratio of tea polyphenols

图3　茶水比对游离氨基酸提取率的影响Fig.3 Effect of tea-leaves and liquid proportion on extraction ratio of free amino acid

2.3pH值对提取效果的影响

酶作用的pH值分别设置为4．0，4．5，5．0，5．5，6．0等5个不同梯度，其他酶解条件设定为茶水比为1∶10，复合酶添加量0．9％，酶解温度70℃，酶解时间50min进行试验，测定茶汤中的茶多酚、游离氨基酸总量的提取率，结果见图4和图5．

pH不仅对酶的活性有影响，还对底物的解离形态有一定影响．在最适pH条件下进行提取，茶多酚、游离氨基酸总量的提取效率最高［12］．由图4和图5可知：随着pH值的增大，茶多酚和游离氨基酸总量的提取率呈现先上升后下降趋势，当pH值为5．0时，茶多酚和游离氨基酸总量的提取率达到最高峰值，分别为3．78％和4．48％，此时复合酶酶活性最高，不仅对细胞壁造成破坏，还影响了传质阻力，从而有益于各组分的提取；因此，选择pH值5．0为最佳pH值．

图4　pH值对茶多酚提取率的影响Fig.4 Effect of pH on extraction ratio of tea polyphenols

图5　pH值对游离氨基酸总量提取率的影响Fig.5 Effect of pH on extraction ratio of free amino acid

2.4酶解温度对提取效果的影响

酶解温度分别设置为50℃，60℃，70℃，80℃，90℃，100℃等6个不同梯度，其他酶解条件设定为茶水比为1∶10，复合酶添加量0．9％，酶解温度70℃，酶解时间50min，pH值5．0进行试验，测定茶汤中的茶多酚、游离氨基酸总量的提取率，结果见图6和图7．

由图6～图7可见：随着酶解温度的升高，茶多酚和游离氨基酸总量提取率呈先上升后下降的趋势，在70℃时复合酶活性最高，最大程度裂解细胞壁，此温度下的茶多酚和游离氨基酸总量的提取率达到最高，分别为3．73％和4．85％；酶解温度高于80℃后，酶活力减弱，提取率呈现下降趋势；因此，选取酶解温度70℃为最适作用温度．

图6　酶解温度对茶多酚提取率的影响Fig．6 Effect of enzymolysis temperature on extraction ratio of tea polyphenols

图7　酶解温度对游离氨基酸总量提取率的影响Fig．7 Effect of enzymolysis temperature on extraction ratio of free amino acid

2．5酶解时间对提取效果的影响

酶解时间分别设置为50min，80min，110min，140min，170min，200min等6个不同梯度，其他酶解条件设定为茶水比为1∶10，复合酶添加量0．9％，酶解温度70℃，pH值5．0进行试验，测定茶汤中的茶多酚、游离氨基酸总量的提取率，结果见图8和图9．

由图8～图9可见：茶多酚和游离氨基酸总量提取率随着酶解时间的延长呈现先上升后下降趋势，酶解时间为140min和170min时茶多酚提取率较为接近最大值，分别为3．85％和3．87％；游离氨基酸总量提取率在140min时达到最大值，为4．63％，随后呈下降趋势；可见酶解时间过长会影响酶活力，从而影响了茶汤营养成分的提取效果；因此，选择140min为最佳酶解时间．

图8　酶解时间对茶多酚提取率的影响Fig．8 Effect of enzymolysis time on extraction ratio of tea polyphenols

图9　酶解时间对游离氨基酸总量提取率的影响Fig．9 Effect of enzymolysis time on extraction ratio of free amino acid

2．6酶添加量对提取效果的影响

复合酶添加量（m／v）分别设置为0．3％，0．6％，0．9％，1．2％，1．5％，1．8％等6个不同梯度，其他酶解条件设定为茶水比为1∶10，酶解温度70℃，酶解时间140min，pH值5．0进行试验，测定茶汤中的茶多酚、游离氨基酸总量的提取率，结果见图10和图11．

由图10～图11可知：随着复合酶用量的增加，茶多酚和游离氨基酸的提取率均呈现先升高后下降趋势．酶用量为0．9％至1．5％时，茶多酚提取率均达到为4．30％以上，酶用量为1．5％时提取率为4．33％；游离氨基酸总量的提取率在复合酶用量为1．2％时达到4．14％，酶用量为1．5％时达到最高值，为4．64％．继续增大酶用量，提取率呈现下降趋势．分析原因可能是：随着酶用量增加，酶与底物作用的机会逐渐增多，酶的催化效率也逐渐升高，当底物与酶完全结合后，继续增加酶量就会抑制酶的活性；因此，选择1．5％为最佳复合酶添加量．

图10　酶添加量对茶多酚提取率的影响Fig．10 Effect of enzyme concentration on extraction ratio of tea polyphenols

图11　酶添加量对游离氨基酸总量提取率的影响Fig．11 Effect of enzyme concentration on extraction ratio of free amino acid

3　小结

酶的应用领域广泛［13－14］，将酶解法应用于浸提茶叶制备茶汤，具有反应特异性强、条件简便、时间短、效率高、环保节能等特点，已引起了科研人员的普遍关注，随着时间的推移，酶法提取势必会成为茶叶产品开发研究的首要技术措施［15］．酶法提取茶多酚不仅可以提高提取率，而且可以使茶多酚的主要生物活性组分——儿茶素的氧化损失减少，可见该法具有广阔的应用前景［16］．有研究提出茶叶的半纤维素和纤维素的表层上覆盖有果胶类物质，利用果胶酶来降解果胶构成的保护膜，可以促进半纤维素和纤维素的分解［17］．

在茶饮料的生产标准中，茶多酚和氨基酸含量是重要的质量指标，茶多酚是茶叶中酚类物质及其衍生物的总称，具有消除机体有害自由基、抗衰老、抗辐射、抑制癌细胞、抗菌杀菌等功效．氨基酸是构建生物机体的众多生物活性大分子之一，是构建细胞、修复组织的基础材料，在茶汤中是主要的营养成分，也是造成茶汤味道甘美的主要因素．本研究利用纤维素酶和果胶酶复合使用的双酶解法对青钱柳茶叶进行茶汤浸提，以茶多酚和游离氨基酸总量的提取率为指标考察茶汤制备效果，并得到最佳浸提工艺条件为：茶水比为1∶10，双酶（纤维素酶∶果胶酶＝2∶1，m／m）添加量为1．5％（m／v），酶解反应温度70℃，酶解反应时间140min，酶解pH值5．0，在此条件下青钱柳茶汤中的茶多酚和游离氨基酸可获得较理想的提取效果，制备得到的茶汤颜色清亮透明，具有青钱柳茶特有的甜香风味．可见使用双酶法制备青钱柳茶汤可较好地保持其风味特点，又能提高其营养成分茶多酚和氨基酸的提取率，若将该法应用于青钱柳茶饮料制备的工业化生产，预计可有良好的应用前景．

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（学科编辑：黎娅）

The preparation of the Cyclocarya paliurus tea with enzyme method

HU ANG Yao1，GAO Nian-fen1，TAN Jun-cheng2，YI Yi1，CHEN Jie1，HUANG Jian-xing2，CHEN Zhen-kun2
（1．School of Biological and Chemical Engineering，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006，China；2．Liuzhou Cyclocarya paliurus Agricultural Technology Development Limited Company，Liuzhou 545006,China）

Double enzyme method(cellulose:pectinase=2∶1,m/m)was used to prepare Cyclocarya paliurus tea, and the preparation process conditions were studied.The results showed that the optimal preparation process were as fellows:double enzyme concentration was1.5％(m/v),reaction temperature at70℃,reaction time for 140min, reaction pH of 5.0.The extraction ratio of tea polyphenols 4.33％and the extraction ratio of total free amino acid 4.64％from Cyclocarya paliurus tea soups were obtained in the optimal conditions.Double enzyme method can be used for tea preparation and good extraction effect can be obtained.The paper gives reference to market development of Cyclocarya paliurus tea.

Cyclocar ya paliurus tea;cellulase and pectinase;tea polyphenols;free amino acids

TS272.55

A

2095-7335（2016）04-0116-06

10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2016.04.021

2016-04-27

广西大学生创新创业训练计划项目（201410594042）资助.

黄瑶，硕士，讲师，研究方向：生物技术，E-mail：5530836＠qq.com.