土壤微生物16S rDNA的T-RFLP法医学应用分析

陈尚坤王旭东张晓嘉王佳琦张更谦

（1　吉林警察学院　吉林　长春　130117；2　西南政法大学　重庆　401120；3　山西医科大学　山西　太原　030001）

土壤微生物16S rDNA的T-RFLP法医学应用分析

陈尚坤1王旭东2张晓嘉3王佳琦3张更谦3

（1吉林警察学院吉林长春130117；2西南政法大学重庆401120；3山西医科大学山西太原030001）

用T-RFLP法观察不同地域土壤微生物的多态性，为法医学土壤分析提供适当的研究方法。采集自吉林和重庆两地的土壤样本，用PowerSoil®试剂盒提取土壤细菌DNA。PCR扩增16S rDNA基因的多态性区域，引物的5’端采用FAM标记。扩增产物分别用HaeⅢ，AluⅠ内切酶消化后，在3130 Genetic Analyzer电泳分离。采用主成分分析（PCA） 法和主效可加护作用可乘模型（AMMI）进行统计分析。通过采用HaeⅢ酶切后，T-RFLP法可以明确分离重庆和吉林两地的土壤样本；AluⅠ酶切后分离效果稍差。得出T-RFLP法可以区分来自不同地域的土壤样本，为法医学土壤多样性分析提供了可靠的分析方法和结论。

土壤细菌16S rDNA末端-限制性长度多态性主效可加护作用可乘模型

土壤中含有丰富的细菌、真菌、病毒等微生物，其多态性组成深度影响着土壤的性质和环境。土壤微生物在农业，环境分析等领域得到充分的重视和研究。土壤微生物的多态性表现为地域、时间、土壤性质、环境影响等方面。土壤中的众多微生物至今未在实验室成功培养，例如土壤中的细菌有95%～98%未能在实验室成功培养。因此，通过其多态性集中的DNA区域如16S rRNA、18S rRNA基因等去分析土壤的宏基因组。近年来，法医也越来越重视土壤微生物分析［1］。相关的探索领域包括微生物的个体识别，土壤细菌的改变与死亡时间的关系等［2］。

末端-限制性长度多态性（Terminal-Ristriction Fragment Length Polymorphism，T-RFLP） 是研究土壤宏基因组的方法之一。本文采用T-RFLP结合主成分分析的方法（PCA）和主效可加护作用可乘模型（AMMI）研究不同地域土壤的细菌DNA多态性，观察其变异程度，探讨用不同的酶切和分析方法来区分不同地域土壤的可行性，为法医学应用该类多态性和方法进行技术探讨［3-4］。

1　材料

1.1土壤收集

土壤样本共24个，分别来自吉林省和重庆市，具体见下表。

1.2实验材料

PowerSoil®土壤微生物DNA提取试剂盒（MO BIO，美国）；内切酶HaeⅢ和AluⅠ（New England Biolabs，英国）；rTaq和dNTP（Takara，日本）；引物序列为8F：5'FAM-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，785R：5'-ACTACCTGGGTATCTAATCC，扩增产物总长度约777bp［5］；引物合成和标记由生工生物工程（上海）股份公司完成。

2　方法

2.1土壤DNA提取与扩增

采用MO BIO PowerSoil®土壤微生物DNA提取试剂盒，取250mg的样品加入power Bead管中，加入C1溶液混匀10min，10000g离心10min，转移上清液，分别加入C2、C3、C4液，每次10000g离心1min。每次取600μL加入过滤柱中，10000g离心1min，重复3次，C5、C6液分别洗涤一次。收集离心管中的DNA。将样本跑琼脂糖电泳确认DNA分离结果，并测定样本OD值，计算其浓度。

用ABI PCR 9700扩增仪进行扩增。扩增条件如下：缓冲液（PCR Buffer）5μL、dNTP4μL、上游引物（8F）2μL、下游引物（785R）2μL、rTaq 0.6μL、样本DNA 100ng、加超纯水至总体积50μL。PCR反应条件：95℃5min预变性；95℃10s，55℃1min，72℃30s，共36个循环；72℃10min，4℃保存。

表　土壤样本

2.2酶切

扩增结束后，将扩增产物分别用HaeⅢ，AluⅠ酶切。酶切体系为25μL体系：buffer2.5μL、内切酶（HaeⅢ，AluⅠ） 1μL，超纯水11.5μL、扩增产物10μL。放置于37℃水浴条件下过夜后煮沸灭活内切酶。

2.3电泳和自动分析

电泳在ABI公司Genetic Analyzer 3130分析仪上进行。具体步骤如下：取去离子甲酰胺9.5μL、0.2μL内标（LIZ 500）、1.5μL酶切产物混合后95℃3min，立即冰浴。然后在3130机器中上样电泳。用GeneMapper3.2分析电泳结果。显示每个实际位置，BIN设置为±0.5bp，大于此值的被认为是不同的峰，即不同的OTU（Operational Taxonomic Units）。

2.4统计分析

选取90～500bp之间的所有峰高大于50的峰。记录峰的大小、峰高和峰面积，作为原始数据。将其用T-REX软件进行在线匹配（http：//trex.biohpc.org/），并生成矩阵。对于该矩阵分别采用IMMA分析和PCA分析。IMMA分析由T-REX在线完成，PCA分析由IBM SPSS23.0完成。样本分析采用两种指标：①峰的有无；②峰面积。

3　结果

3.1T-RFLP图谱在不同地域的土壤的差别

T-RFLP结果显示用HaeⅢ酶切后来自同一地区的土壤有着更多的形态相同的峰：样本4、样本9、样本10取自重庆市，样本15、样本16、样本17取自吉林省；而来自不同地区的土壤峰形差别较大，其特征峰（箭头所示）的片段大小和高度及峰度都相差较大，一些峰为某些地域所特有的，而在其他地区没有，能够区别来自不同地区的土壤，如图1所示。用AluⅠ酶切后，同一地区的土壤样本仍有相同特征峰，但不同地区土壤峰形差别较小，没有显著差别，效果不及HaeⅢ酶，如图2所示。

图1　用HaeⅢ酶切不同地域土壤样本的T-RFLP图谱

3.2重复性实验

所得T-RFLP图有一定的相似性，土壤样本距离越近，T-RFLP图谱越相似，其特征峰的片段大小高度相近，即采自于同一片区域的样本重复性较好。样本4、样本9均为在登山道右侧菜地2m内所采集的土壤，样本10为与样本4、9距离50m，样本4和样本9更为接近，T-RFLP图谱更相似。如图1所示。

图2　用AluⅠ酶不同地域的土壤样本切的T-RFLP图谱

3.3PCA分析

用HaeⅢ酶切后，分别用T-RFLP的峰的有无和峰面积进行PCA分析，得到散点图。两地区土壤样本集中，不能将地域分开，如图3所示。用AluⅠ酶切后，进行PCA分析后，较HaeⅢ酶切离散，也不能区分地域，如图4所示。

图3　HaeⅢ酶切后的PCA分析图

图4　AluⅠ酶切后的PCA分析图

3.4AMMI分析

分别以峰高、取样位置、取样高度作为环境因素和峰面积、取样位置、取样高度作为环境因素，对两种酶切后的样本的T-RFLP进行分析。HaeⅢ酶切后在设定两种环境因素条件下的AMMI图分布一致，并且能够区分两地区的土壤。吉林土壤样本集中，重庆的土壤样本较为离散，取样的环境对土壤的性质有影响，主要是取样位置不同，如不同高度位置（13号样本山顶，7号样本山脚），不同湿度（2号样本水塘，10号样本路边干燥处）显示出了较大的差异性，如图5所示。AluⅠ酶切后AMMI分析，不能区分两地区土壤样本，如图6所示。

图5　HaeⅢ酶切的AMMI分析数据图

图6　AluⅠ酶切后的AMMI分析数据图

4　讨论

影响土壤环境的因素众多，造成微生物群落组成的差别，这种差别是T-RFLP法区分不同土壤的理论基础——即用内切酶切割后产生不同大小的DNA片段，通过末端标记的荧光PCR产物的电泳差异显示出来。每一份不同的土壤应该显示不同的DNA图谱和特征峰，即OUT［6］。法医学者最关心的是如何用适当的方法去评估区分这种差别。

本文用T-RFLP分析不同地域土壤细菌16S rRNA基因的多态性。结果表明，采用该方法可以成功提取大部分不同地域土壤的DNA并成功扩增和分析。不同地域的土壤微生物采用适当的分析方法后，可以得到有效的分离。采用适当引物和内切酶的T-RFLP分析方法可成功分析不同地域和不同环境的土壤。

本文中采自吉林的9份土壤样本中，8份样本可成功扩增分析；采自重庆的32份土壤样本中，有16份样本可成功扩增分析。即使在琼脂糖电泳后清晰观测到土壤微生物的DNA条带，仍无法获得PCR产物，我们曾用多种纯化方法，均无法扩增出来。分析可能与该地区土壤腐殖酸等抑制扩增的物质含量过多，抑制PCR扩增。分析土壤时必须注意：土壤环境多样，因土壤样品中成分复杂，土壤中常含有抑制扩增的物质，如腐植酸等，如不能有效地去除，对后续PCR的扩增影响较大［7］。

用T-RFLP的方法区别不同地区的土壤，本实验两种酶对土壤鉴别能力是不同的。一方面是由于HaeⅢ和AluⅠ不同，HaeⅢ的识别序列：5’…GG∧CC…，Alu的识别序列：5’…AG∧CT。另一方面不同地区土壤中细菌的种类不同，扩增出片段其序列并不相同，所以酶切后片段大小及峰度不同。用引物+HaeⅢ酶要优于引物+AluⅠ酶的方法。

在对数据进行分析时，我们依据峰的有无和峰面积通过AMMI和PCA两种方法分析。同一种酶切后，峰的有无和峰面积分析后显示分布趋势一致。但AMMI较PCA能较好的分离不同地区的土壤。AMMI模型将主成分分析和方差分析结合，将乘积形式的交互作用加入常规的基因型与环境的加性模型中，对细菌群落及环境因素相互作用进行分析［8］。

土壤的性质不仅受地域不同的影响，同时还受环境的影响如湿度、高度、气温等因素影响［9］。吉林地区的土壤样本主要来自同一高度及相似环境的土壤，AMMI分析时发现分布非常集中；来自重庆的土壤样本离散度较高，主要是取样位置不同，如不同高度位置（13号样本山顶，7号样本山脚），不同湿度（2号样本水塘，10号样本路边干燥处）显示出了较大的差异性。

本文探讨了用不同内切酶结合不同的分析手段进行土壤T-RFLP分析的可行性。结果显示采用合适的方法可以有效分离来自不同地区的土壤，并且重复性好、结果可靠［10，11］。根据结果的一致性看，我们更倾向于AMMI分析。

［1］葛芸英，陈松，胡兰，等.土壤细菌DNA提取及多样性分析的T-RFLP方法［J］.微生物学通报，2008（1）：131-136.

［2］Finley SJ，Pechal JL，Benbow ME，et al.Microbial Signaturesof Cadaver Gravesoil during Decomposition［J］. MicrobialEcology，2016（3）：524-529.

［3］ MacdonaldCA，AngR，CordinerSJ，etal. Discrimination of Soilsat Regionaland LocalLevelsUsing Bacterial and Fungal T-RFLP Profiling［J］.Journal of Forensic Sciences，2011（1）：61-69.

［4］MacdonaldLM，SinghBK，ThomasN，etal.Microbial DNAProfilingbyMultiplexTerminalRestriction Fragment Length Polymorphism for Forensic Comparison of SoilandtheInfluenceof SampleCondition［J］.Journalof AppliedMicrobiology，2008（3）：813-821.

［5］FabriceArmougom，DidierRaoult.ExploringMicrobial Diversity Using 16S rRNA High-Throughput Methods. Journal of Computer Science and Systems Biology，2009（2）：69-92.

［6］Lenz EJ，Foran DR.Bacterial Profiling of Soil Using Genus-specific Markers and Multidimensional Scaling［J］.Journalof ForensicSciences，2010（6）：1437-1442.

［7］张海燕，王彩虹，龚明福，等.一种简单有效且适于土壤微生物多样性分析的DNA提取方法［J］.生物技术通报，2009（8）：151-155.

［8］CulmanSW，BukowskiR，GauchHG，etal.T-rex：Software for the Processing and Analysisof T-RFLP Data［J］.BMC Bioinformatics，2009（10）：171.

［9］马万里，Josquin Tibbits，Mark Adams.土壤微生物多样性研究的新方法［J］.土壤学报，2004（1）：103-107.

［10］Lazzaro A，Hilfiker D，Zeyer J.Structures of Microbial Communities in Alpine Soils：Seasonal and Elevational Effects［J］.Frontiersin Microbiology，2015（6）：1330.

［11］Horswell J，Cordiner SJ，Maas EW，et al.Forensic Comparison of Soils by Bacterial Community DNA Profiling［J］.Journalof ForensicSciences，2002（2）：350-353.

（责任编辑：孟凡骞）

D919.1

A

2095-7939（2016）03-0070-04

10.3969/j.issn.2095-7939.2016.03.016

2016-06-06

吉林省科技发展计划项目（编号：20110424）。

陈尚坤（1969-），女，吉林长春人，吉林警察学院学报编辑部编审，主要从事DNA分析技术研究。