聚乙烯吡咯烷酮-羧甲基壳聚糖原位水凝胶的研究*

刘群峰，陈 军，耿志杰，张 锦，张泽荣，裴大婷

国家医疗保健器具工程技术研究中心，广东省医用电子仪器及高分子材料制品重点实验室，广东省医疗器械研究所，广东 广州 510500



聚乙烯吡咯烷酮-羧甲基壳聚糖原位水凝胶的研究*

刘群峰，陈 军，耿志杰，张 锦，张泽荣，裴大婷

国家医疗保健器具工程技术研究中心，广东省医用电子仪器及高分子材料制品重点实验室，广东省医疗器械研究所，广东 广州 510500

将聚乙烯吡咯烷酮溶液和羧甲基壳聚糖溶液简单混合，通过调整体系pH值可制备出原位水凝胶.经衰减全反射傅里叶红外光谱分析表明，羧甲基壳聚糖与聚乙烯吡咯烷酮之间存在相互作用.该凝胶具有良好的溶胀性能及生物相容性，无细胞毒性.

原位；水凝胶；壳聚糖；溶胀；交联

水凝胶是一种能吸收大量水且具有三维网络结构的物质.通常水凝胶是通过单体交联剂化学交联而成，其缺点是结构中往往含有少量的小分子单体和交联剂等物质，影响水凝胶的相容性[1].近来，原位交联的水凝胶引起了关注，其特点是液态组分可以在生理条件下形成凝胶.形成原位凝胶的主要机理包括：氢键作用、紫外光辐照、离子相互作用等.这些方法都不需要交联剂和引发剂，即可使得原位凝胶具有良好的生物相容性，因此在生物医学领域得到重视[2].

本研究采用聚乙烯吡咯烷酮和羧甲基壳聚糖制备原位水凝胶体系.壳聚糖具有生物降解性和光谱抗菌性能，聚乙烯吡咯烷酮是一种具有高度生物相容性的亲水高分子材料，两者形成的凝胶有望用于创面敷料和药物载体[3-4].聚乙烯吡咯烷酮侧链含有吡咯烷酮结构，通过开环产生羧基或者羧基盐基团.有文献报道开环聚乙烯吡咯烷酮可与壳聚糖中的衍生物发生相互作用形成凝胶[5].本研究发现未开环聚乙烯吡咯烷酮与柠檬酸结合后，可与壳聚糖作用形成性能优异的原位凝胶.

1 试验部分

1.1 主要试剂与仪器

羧甲基壳聚糖(羧化度>60%，南京奥多福尼生物科技有限公司)；壳聚糖(食品级，济南海得贝海洋生物工程有限公司)；聚乙烯吡咯烷酮K90(分析纯，天津市博迪化工有限公司)；氢氧化钠(分析纯，天津市福晨化学试剂厂)；柠檬酸(分析纯，天津启轮化学科技有限公司)；盐酸(质量分数25%，广州化学试剂厂)；透析袋(截留分子量8000～14000，美国Life Science公司)；Nicolet 6700型衰减全反射傅里叶红外光谱分析(ATR，厂商ThermoFisher).

1.2 水凝胶体系的制备

将5 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶于45 g去离子水中，配制质量分数10% PVP溶液.然后添加适量质量分数2%柠檬酸溶液，制成pH为3～5的PVP-K90溶液.将1 g羧甲基壳聚糖溶解于49 g去离子水中，配制质量分数2%羧甲基壳聚糖溶液.按羧甲基壳聚糖溶液和聚乙烯吡咯烷酮溶液的质量比为0.5～1︰1，将PVP-K90水溶液缓慢加入羧甲基壳聚糖溶液中，静置10 min，即可获得半透明的原位凝胶.获得的原位凝胶具有固定形状，但力学强度较弱,触碰容易被破坏.

1.3 凝胶的吸水性能及表征

将干燥的凝胶置于室温水中，每隔一定时间取出样品，用滤纸小心拭去凝胶表面的水并称重，直至样品质量不变为止.时间t时，水凝胶的溶胀率(Rt)为：

Rt=(mt-m0)/m0=Wt/m0，

(1)

式(1)中m0为t=0时凝胶的质量，即干凝胶的质量；mt为时间t时凝胶的质量;Wt即为t时凝胶中水的质量.水凝胶的平衡溶胀率(Re)为：

Re=(me-m0)/m0=We/m0，

(2)

式(2)中me为达到溶胀平衡时凝胶的质量，We为达到溶胀平衡时凝胶中水的质量.

1.4 水凝胶生物相容性评价

主要对原位凝胶的细胞毒性进行检测，样品制备及细胞毒性测试在广东省医疗器械研究所质检部进行.浸提原液组：样品质量0.1 g，加入6 ml血清质量分数为 10 %的MEM细胞培养基.阳性对照：以20%苯酚溶液为浸泡液，用直径10 mm的圆形无菌滤纸片轻轻沾取浸泡液作为阳性对照.阴性对照：以 0.2 g/ml高密度聚乙烯为浸泡液，37 ℃下浸提 24 h，用直径10 mm的圆形无菌滤纸片轻轻沾取浸泡液作为阴性对照.

细胞毒性测试：将传代2次对数生长的3T3(L929)细胞加胰酶消化后加入细胞培养液，吹打均匀后显微镜下计数.根据细胞浓度，加培养液稀释成250000个/ml的细胞悬液，然后在3个平皿中各加入10 ml，置于37 ℃培养箱培养24 h.24 h细胞生长近汇合，弃去原培养液，在每个平皿中分别加入溶化琼脂与含10%血清的MEM培养基的混合液6 ml.待混合培养基凝固后将培养皿分组，分别加入供试品、阳性对照和阴性对照，然后置于37 ℃培养箱继续培养24 h.药物作用24 h后，在皿底标出试验样轮廓，取下琼脂表面试验样，并在各皿中加入0.1%中性红染液2 ml，继续避光培养1 h，最后在显微镜下观察拍照，记录细胞毒性情况.

2 试验结果与讨论

2.1 原位水凝胶的影响因素

本体系的水凝胶是通过聚乙烯吡咯烷酮和羧甲基壳聚糖在室温下简单共混后制得，制备中未采用化学交联剂，形成的水凝胶结构为物理水凝胶.这类水凝胶在一定条件下能发生溶胶-凝胶态的可逆转化，力学强度不高，但是具有良好的生物安全性.表1为组分对形成凝胶的影响.由表1可知，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)与壳聚糖和羧甲基壳聚糖直接作用并不能产生凝胶(1，2号试验)；添加适量的柠檬酸，将体系调至酸性有利于形成凝胶(3，4号试验).在相同的试验条件下，用质量分数2%壳聚糖醋酸溶液和PVP制备水凝胶，没有形成凝胶.可见，在制备水凝胶的过程中，体系的pH值、凝胶的组分等对凝胶的形成有较大的影响.本体系采用柠檬酸来调节体系的pH值，因为柠檬酸为弱酸且广泛用于食品添加剂，具有较好的生物安全性.图1为3号凝胶样品的外观图.由图1可看出，凝胶呈现透明果冻状.凝胶在去离子水中经过长时间的浸泡不发生溶解.

表1 组分对凝胶形成的影响

图1 聚乙烯吡咯烷酮-羧甲基壳聚糖凝胶照片Fig.1 Photo of the hydrogel of polyvinyl pyrrolidone and carboxymethyl chitosan

2.2 水凝胶的形成机理和吸水性能

羧甲基壳聚糖由于含有羧甲基钠结构使其在中性条件下溶于水，聚乙烯吡咯烷酮的侧链存在环羰基结构.两者共混可能产生多重作用：(1)羧甲基壳聚糖与聚乙烯吡咯烷酮形成分子间络合和缠绕[6]；(2)随pH值减小羧甲基壳聚糖的亲水性下降而疏水性增加.前一种作用力主要发生在壳聚糖和聚乙烯吡咯烷酮之间，形成络合物；后一种作用力主要在壳聚糖组分中发生.试验中对形成的凝胶反复用水浸泡、抽取，然后对干燥处理后的凝胶进行衰减全反射傅里叶红外光谱分析(ATR)表征.图2为浸泡、抽取前后样品的ATR图谱.由图2可知，2940 cm-1是聚乙烯吡咯烷酮C—H伸缩振动峰；1644 cm-1是聚乙烯吡咯烷酮C=O伸缩振动和羧甲基壳聚糖NH3峰的叠加，因而这个峰强度较大.通过对比可发现，凝胶在浸泡前后变化不大，说明凝胶中大部分聚乙烯吡咯烷酮在浸泡后仍保留在凝胶中.因而可判断羧甲基壳聚糖与聚乙烯吡咯烷酮之间存在相互作用.

图2 凝胶的红外ATR图谱Fig.2 ATR spectrum of gel

将所制得的原位凝胶先制成高约1 cm小圆柱，然后用乙醇置换出凝胶中的水分，在真空45 ℃下除去乙醇获得干燥凝胶.这种处理方法较简单，同时可保持凝胶在干燥过程中不发生较大的形变而脆裂.通过称量干燥凝胶片的吸水量可测试原位水凝胶的吸水性能.试验结果表明，聚乙烯吡咯烷酮-羧甲基壳聚糖原位凝胶体系的溶胀性对pH值的变化较敏感.在碱性溶液(pH﹥8)中进行溶胀，凝胶会较快溶解.原因是碱性环境下壳聚糖羧基的亲水性变大，分子链产生溶解作用，从而破坏了凝胶结构.图3为中性和酸性条件下凝胶的吸水溶胀曲线.从图3可以看出，原位凝胶在pH=5.5弱酸性介质中具有良好的吸水性能，吸水倍率可达7倍；在中性介质中的吸水倍率能达8.2倍，溶胀平衡时间均为3 h.

图3 凝胶溶胀曲线Fig.3 Gel swelling curve

2.3 水凝胶的生物相容性评价

与通过戊二醛等化学交联制备的壳聚糖水凝胶相比，聚乙烯吡咯烷酮-羧甲基壳聚糖原位自交联水凝胶是一种通过物理相互作用形成的水凝胶，不含有毒的小分子物质，因而具有良好的生物相容性.对制备的原位凝胶，不作任何处理直接进行细胞毒性试验.细胞毒性试验形态如图4所示.图4显示，原位凝胶样品(图4c)的细胞形态正常，无细胞溶解，细胞毒性计分为0，无细胞毒性；阴性对照组(图4a)的细胞形态正常，无细胞溶解，细胞毒性计分为0，无细胞毒性；阳性对照组(图4b)的整个培养区细胞层几乎完全破坏，细胞溶解，细胞毒性计分为3，重度细胞毒性.可见，本研究原位形成的水凝胶具有良好的细胞相容性.

图4 原位凝胶的细胞毒性测试(a)阴性对照; (b)阳性对照;(c)原位凝胶Fig.4 The cell toxicity test of in situ gel (a) negative control;(b) positive control;(c) in situ gel

3 结 论

将聚乙烯吡咯烷酮溶液和羧甲基壳聚糖溶液简单混合，通过调整适当的pH值，可制备出原位水凝胶.该方法简单有效，制备的凝胶具有良好的吸水溶胀性，且生物相容性良好，无细胞毒性，有望作为一种新型的生物医用材料，如用作创面敷料、组织工程支架、药物载体、细胞培养基等.

[1] 王薇，关国平，王璐.生物医用水凝胶研究进展[J]. 生物医学工程学展，2015，36(4): 221-225.

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[3] SMITH Le, COLLNS S, LIU Z, et al.Synthesis and properties of functional poly(vinylpyrrolidinone) hydrogels for drug delivery polymers for biomedical applications[J].ACS Symposium Series，2009，977(1): 196-203.

[4] KUMAR M，MUZZARELLI R，MUZZARELLI C，et al.Chitosan chemistry and pharmaceutical perspectives chem[J].Rev，2004，104(12): 6017-6084.

[5] D’SOUZA A，SCHOWEN R, TOPP E M. Polyvinylpyrrolidone-drugconjugate：synthesis and release mechanism[J]．J Control Release，2004，94：91-100．

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Research about a in situ hydrogel of polyvinyl pyrrolidone and carboxymethyl chitosan

LIU Qunfeng，CHEN Jun，GENG Zhijie，ZHANG Jin，ZHANG Zerong,PEI Dating

NationalEngineeringResearchCenterforHealthcareDevices，GuangdongKeyLabofMedicalElectronicInstrumentsandPolymerMaterialProducts，GuangdongInstituteofMedicalInstruments，Guangzhou510500，China

In the research, an in-situ hydrogel was prepared by simple blending of the polyvinyl pyrrolidone solution and the carboxymethyl chitosan solution and adjusting the pH value. Attenuated total internal reflectance Fourier transform infrared spectroscopy analysis showed that there was an interaction between carboxymethyl chitosan and polyvinyl pyrrolidone. The gel had good swelling property and bio-compatibility without cell cytotoxicity.

in-situ；hydrogel；chitosan；swelling；cross-linking

1673-9981(2016)03-0209-05

2016-08-17

广东省高新技术产业化项目(2012B010200029)；广州市科技攻关项目(2013J4300038)

刘群峰(1977-)，男，湖南邵阳人，副教授，博士.

TQ427.6

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