RP-HPLC法测定迷迭香药材中鼠尾草酸

 李　海，李鹏辉，黄惠华，李佳银 

（1.华南理工大学，广东　广州　510641；2.湖南农业大学，湖南　长沙　410128；3.湖南三福生物科技有限公司，湖南　长沙　410100）

RP-HPLC法测定迷迭香药材中鼠尾草酸

李海1，李鹏辉2，黄惠华1，李佳银3

（1.华南理工大学，广东广州510641；2.湖南农业大学，湖南长沙410128；3.湖南三福生物科技有限公司，湖南长沙410100）

为建立高效液相色谱法测定迷迭香中鼠尾草酸含量的方法，以乙腈-0.1%磷酸水（60∶40）为流动相，检测波长为230 nm；柱温30℃，等度洗脱，流速为1.0 mL/min。结果显示，鼠尾草酸在0.277 2～1.016 4 mg/mL范围具有良好的线性关系（R2=0.999 92），回收率为97.56%。该方法快速、灵敏、准确，目标峰分离度良好，可为迷迭香药材以及提取物的质量控制提供依据。

高效液相色谱；迷迭香；鼠尾草酸

迷迭香（Rosmarinus officinalis L.），别名艾菊，系唇形科迷迭香（Rosmarinus）属植物[1]，味辛、性温，原产于欧洲、北非以及地中海等地区，在中国云南、贵州和新疆等地有广泛种植[2-3]。现代研究表明，鼠尾草酸（Carnosic acid，简称CA）是迷迭香中抗氧化能力最强的活性成分[4-5]，含量一般在2.2%～3.1%[4-5]，作为一种安全无毒副作用的高效纯天然抗氧化剂，广泛应用于化妆品、各种植物油脂、肉制品、调味品、油炸食品、烘培食品等领域[6-7]，具有极大的市场需求和潜力，预计到2020年，迷迭香提取物市场需求将突破1万t。因此，建立高效、稳定、可靠的迷迭香鼠尾草酸检测方法，从资源、产品等方面进行严格的质量控制，对保障迷迭香深度开发具有重要意义。目前国内外对迷迭香中鼠尾草酸的含量测定，主要有高效液相色谱、紫外分光光度法、气相色谱、高效液相色谱-质谱联用等方法[8-11]，其中高效液相色谱法主要采用梯度洗脱法，但由于鼠尾草酸的最大紫外吸收波长位于230 nm左右，接近常规流动相的紫外截止波长，而常规液相色谱仪在梯度洗脱中又无法扣除流动相的本底吸收，容易造成基线漂移，并导致检测结果的可靠性和稳定性受到一定的影响，对高效液相色谱仪的选择要求也较高，一定程度上制约了这些方法的广普应用。试验以乙腈-0.1%磷酸水为流动相，建立迷迭香中鼠尾草酸的HPLC等度洗脱方法，有效地解决了上述问题，且检测结果稳定、可靠、高效，具有较好的广普性，为迷迭香中鼠尾草酸的开发利用提供了有力的理论依据。

1　材料与方法

1.1仪器与设备

高效液相色谱仪（紫外检测器），日本岛津；色谱柱C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司（KQ3200B）；电子天平（METTLER AE240）。

1.2药材与试剂

迷迭香药材由湖南三福生物科技有限公司提供，鼠尾草酸标准品购于美国Sigma-Aldrich公司。乙腈为色谱纯，购于美国Spectrum公司；其余试剂均为分析纯，广州国药集团。

1.3色谱条件

流动相：乙腈-0.1%磷酸水（60∶40，v/v）；检测波长：230 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；进样量：20 μL。

1.4供试品溶液的制备

迷迭香叶片除沙石等机械杂质后进行切断处理（约1 cm），自然阴干后粉碎，并过20目药筛。精密称取迷迭香粉末21.8 mg，置50 mL容量瓶中，加无水乙醇40 mL，超声处理20 min，待冷却加无水乙醇定容至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）过滤，备用。

1.5对照品溶液的制备

精密称定鼠尾草酸对照品10.05 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，加少量的无水乙醇超声溶解，待冷却后定容，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）过滤，备用。

2　结果与分析

2.1色谱条件的优化

精密量取适量标准溶液流动相溶解后，在190～500 nm进行全波长紫外扫描。结果表明，标准溶液的鼠尾草酸在230、280和331 nm各有1个吸收峰（图1）。其中230 nm是其最大吸收波长，灵敏度高，重现性好；同时在230 nm处样品谱图中杂质干扰较少，因此选用230 nm作为检测波长。鼠尾草酸在17 min左右出峰，峰形良好，灵敏度高，重现性好，样品中鼠尾草酸的峰形及与其他杂峰的分离度最为理想（图1）。

图1　鼠尾草酸标准品与迷迭香药材的HPLC对比图谱

2.2线性回归方程与相关系数

精密吸取对照品溶液0.3、0.5、0.7、0.9和1.1 mL，分别置于10 mL棕色容量瓶中，用无水乙醇稀释定容，配成系列浓度的标准溶液，按色谱条件测定峰面积。以进样浓度C（μg/mL）为横坐标，峰面积A（mm2）为纵坐标绘制标准曲线，进行回归计算得线性回归方程为：y=8×107X+5 000 000，R2=0.999 92。标准曲线见图2。

图2　鼠尾草酸标准曲线

2.3精密度实验

精密吸取对照品溶液（鼠尾草酸浓度为0.635 mg/mL）重复进样6次，按色谱条件测定峰面积，计算其RSD为1.15%，表明该方法具有良好的精密度。

2.4稳定性试验

稳定性分析对放置不同时间（0、4、8、12、16和20 h）的供试品溶液分别进行HPLC分析，测定、记录峰面积，考察鼠尾草酸的含量变化，计算其RSD为2.45%。表明供试品溶液在室温条件下放置20 h比较稳定。

2.5重复性试验

取同一批次的迷迭香药材6份，按供试品溶液制备方法制备，并按色谱条件测定，按外标法计算。测得迷迭香中鼠尾草酸的平均含量为2.42%，其RSD为2.05%，该方法重复性较好。

2.6回收率试验

准确称取已测定含量的迷迭香粉末约40 mg（精确至0.01 mg）作为空白，分别置于50 mL容量瓶中，加入对照品适量，按供试品溶液制备方法制备，并按色谱条件测定样品的加样回收率，结果见表1。

表1　加样回收率试验结果

3　结论与讨论

由于受常规有机流动相紫外截止波长的影响，在HPLC梯度洗脱法中，常规液相色谱仪无法扣除流动相比例变动多带来的本底吸收效应，容易造成基线漂移，进而导致检测的可靠性和稳定性受到一定的影响。试验以乙腈-0.1%磷酸水为流动相，建立了迷迭香中鼠尾草酸的HPLC等度洗脱方法，有效地解决了上述问题。鼠尾草酸是迷迭香药材中的主要活性成分，但根据文献报道容易转化成鼠尾草酚，试验全部采用无水乙醇作为溶剂，有效地避免了鼠尾草酸的降解。结果表明，鼠尾草酸在277.2～1 016.4 μg/mL范围具有良好的线性关系，R2=0.999 66，回收率为97.56%，结果稳定、可靠、高效，具有较好的广普性，为迷迭香中鼠尾草酸的开发利用提供了有力的理论依据。

[1] 刘兴宽，郁建平，连 宾，等.贵州引种的迷迭香（Rosmarinas officinalis L.）中挥发油化学成分分析[J]. 贵州大学学报（农业与生物科学版），2002，21（3）：186 -190.

[2] 常 静，肖绪玲. 我国引种的迷迭香抗氧化成分的分离和抗氧化性能研究[J]. 化学通报，1992，（3）：30-33.

[3] 吕顺端，梅家东，袁良济. 迷迭香扦插育苗试验研究[J]. 现代农业科技，2010，（5）：179，182.

[4] Paris A，Strukel J B，Renko M，et al. Inhibitory effect of carnosolic acid on HIV-1 protease in cell-free assays[J]. J Nat Prod，1993，56（8）：1426-1430.

[5] Richheimer S L，Matthew W，Bernart，et al. Antioxidant activity of lipid-soluble phenolic diterpenes from rosemary[J]. J AOCS，1996，73（4）：507-514.

[6] Moran L，Andres S，Bodas R，et al. Meat texture and anti-oxidant status are improved when carnosic acid is included in the diet of fattening lambs[J]. Meat Science，2012，91（4）：430-434.

[7] Zhang Y，Yang L，Zu Y G，et al. Oxidative stability of sun-flower oil supplemented with carnosic acid compared with syn-thetic antioxidants during accelerated storage[J]. Food Chem，2010，118（3）：656-662.

[8] 陈四利. 迷迭香有效成分的提取与结构研究[D]. 海口：海南大学，2009.

[9] 杨海麟，鲁时瑛，杨胜利，等. 迷迭香抗氧化剂的提取方法研究[J].天然产物研究与开发，2002，l4（4）：20-23.

[10] 郑秋闽. 迷迭香抗氧剂的提取和鉴定[J]. 潍坊学院学报，2010，10（4）：95-98.

[11] 刘先章，赵振东. 迷迭香提取物检测方法研究进展[J].林产化学与工业，2011，24（增刊1）：l32-138.

（责任编辑：夏亚男）

Determination of Carnosic Acid in Rosemary by RP-HPLC

LI Hai1，LI Peng-hui2，HUANG Hui-hua1，LI Jia-yin2
（1. South China University of Technology,Guangzhou 510641, PRC; 2. Hunan Agriculture University, Changsha 410100, PRC; 3. Hunan Sunfull Bio-tech Co., Ltd, Changsha 410100, PRC）

To establish a HPLC method for the determination of carnosic acid in Rosemarinus officimalis L.， the anaiysis was carried out on Pheromenex Ecosil C18 column (200 mm ×4.6 mm，5 μm)， the mobile phase was composed of actonitrile and 0.1% phosphoric acid aqucous (60∶40， v/v).The detection wavelength was 210 nm， with flow rate 1.0 mL/min at column temperature of 30 ℃.The standard curve of linear relationship was of 0.277 2-1.016 4 mg/mL and R2=0.999 92， average recovery was 97.56%. The method was accurate，sensitive， simple and reliable for the determination of carnosic acid in Rosemarinus oficinalis L.， suitable for the quality evaluation of Rosemarinus officinalis L.

HPLC; Rosemarinus officinalis L.; carnosic acid

R284

A

1006-060X（2016）10-0087-02

2016-08-26

李 海（1992-），男，湖南岳阳市人，硕士研究生，研究方向：食品工程。

黄惠华