两种典型制糖工艺过程蛋白质含量的差异

韦　海，刘慧霞，周文红

（广西大学轻工与食品工程学院，广西　南宁　530004）

两种典型制糖工艺过程蛋白质含量的差异

韦海，刘慧霞，周文红

（广西大学轻工与食品工程学院，广西南宁530004）

为比较碳酸法和亚硫酸法两种典型工艺过程糖物料的蛋白质含量差异，测定了两种工艺各段糖物料的蛋白质含量。试验表明，采用考马斯亮蓝法，波长595nm，反应时间10～30min，标准蛋白质溶液线性关系、精密度、重现性、加标回收试验表现良好；制糖清净过程能除去约94%～98%的蛋白质，碳酸法工艺蛋白质除去率较高；后序工段的蛋白质含量按精糖浆、粗糖浆、甲原蜜、乙原蜜依次升高，精糖浆比粗糖浆蛋白质低约10%～30%，甲原蜜比乙原蜜低约30%～50%，碳酸法厂各相应物料蛋白质含量都低于亚硫酸法厂。

制糖工艺；蛋白质；考马斯亮蓝法

0　前言

甘蔗汁中的蛋白质对制糖过程有很大影响，蔗汁大部分的蛋白质在澄清过程中凝结成为沉淀物，可以帮助除去其他杂质。但残留的蛋白质以及分解的含氮物质会对后续的制糖过程有多种不良影响。蔗汁蛋白质含量与甘蔗品种和质量有直接的关系，新鲜成熟甘蔗中约占含氮物的65%～70%，但不新鲜或未成熟甘蔗，经受风折、霜冻、虫害等自然灾害甘蔗中，蛋白质含量可降到40%～20%［1］。

蛋白质是典型的两性高分子物质，甘蔗汁中蛋白质等电点约在pH3.3～3.8［2］，制糖生产的清净过程，蛋白质与钙离子等正电离子结合而被沉淀除去。学者M.Bennnett［3］研究了蔗汁中蛋白质和钙的作用，蛋白质结合的钙量随汁中钙离子浓度升高而增大，并随pH升高而增大。蛋白质具有很强的表面活性，在制糖过程受热凝结可覆盖各种憎水微粒使其凝结除去，对蔗汁起到除杂脱色的效果，对澄清是有益因子。而某些难凝结除去的蛋白质能与多糖或者其他有机物结合，容易形成浑浊溶液［4］，是制糖过程的有害因子。学者李鲜能等［5］测定了高浓度糖物料的蛋白质含量，粗糖浆、精糖浆、甲洗、甲原、乙原含量分别为224、183、257、336、628 mg/kg·oBx。Ermolaeva，Stansbury，Roberts等［6-8］人分析了白砂糖和精糖的酸性絮凝物，发现蛋白质是其主要成分之一；学者黄凯［9］，莫佳琳［10］的研究也表明，白砂糖酸性絮凝物中的蛋白质等含氮物占比约为21.5%～33.7%，而酸性絮凝物是影响白砂糖质量的一个重要因素。

综上所述可知，糖物料中蛋白质含量的差异直接影响到造蜜因子、提糖率和产品质量，而制糖过程糖物料蛋白质含量的检测数据尤其是碳酸法和亚硫酸法工艺过程糖物料的蛋白质含量的差异研究仍鲜见报道。本文首先研究了考马斯亮蓝比色法测定糖物料的蛋白质含量的可靠性，对该方法的线性关系、回收率、精密度、稳定性等进行了考察。然后分析了碳酸法和亚硫酸各工段物料的蛋白质含量，比较了两种工艺段物料的蛋白质含量差异，为蔗汁清净和后续工艺管理的改善提供一些参考依据。

1　材料与方法

1.1实验原理

考马斯亮蓝比色法是由Bradford等人建立的测定微量蛋白质的方法［11］，考马斯亮蓝所含疏水基团在酸性条件下与蛋白质的疏水微区具有亲和力，通过疏水作用与蛋白质相结合，形成的蓝色蛋白质-染料复合物，在595nm处有最大吸光度，复合物1h内保持稳定；在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在595nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质含量的测定。该方法具有快速、稳定、灵敏度高、测量结果准确等特点。该方法最低检出限为1μg，只添加一种试剂就可以完成测定，且干扰物少，不受钾离子、钠离子、镁离子、糖和蔗糖、酚类化合物以及游离氨基酸等物质的干扰［12-13］。此方法已被用于果汁、乳制品、野木瓜多糖等［14-16］物质的蛋白质含量测定，均收到了良好的效果。

1.2实验试剂

考马斯亮蓝G250；95%乙醇；磷酸；牛血清蛋白。

1.3实验设备

722N可见分光光度计；YP2001电子分析天平；台式高速离心机；101-1A型数显示电热恒温干燥箱；数字阿贝折光仪。

1.4溶液的配置

考马斯亮蓝G-250溶液：称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL95%乙醇中，加入100mL85% （W/V）磷酸，将溶液用水稀释到1000mL，用滤纸过滤，存于棕色瓶中。［试剂的终含量为：0.01%考马斯亮蓝G-250，4.7%（W/V）乙醇，和8.5%（W/V）磷酸］。

蛋白质标准溶液：精确称取牛血清白蛋白10.00 mg，用蒸馏水溶解并定容至100mL，即为0.1mg/mL蛋白质标准液，保存于4℃～5℃冰箱中。

1.5待测糖液的制备

取待测糖汁用离心机离心15min（4000r/min），然后用双层滤纸过滤，测定其锤度，备用；称取适量备用样（保证所测值在标曲范围内为准），用蒸馏水稀释至50ml，摇匀待测。

1.6标准曲线的制作

取11只试管，编号为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，按照表1依次加入各试剂，混匀，静置10min，以0号试管作空白对照，测定各标准样品在595nm下的吸光度值。结果见2.1。

表1　牛血清蛋白标准曲线的制作

1.7样品测定

取处理好的糖液样品各2mL，加入8mL考马斯亮蓝G-250溶液，每种样品取3份。再取一个试管依次加入2mL样液和8mL水，作样品空白。以表1中0号试管试剂为空白参比液，并按上述标准曲线的测定方法分别测定其吸光度值，以3次测定的平均值作为该糖液样品蛋白质含量的实测值。糖液样品蛋白质最终含量计算公式为：

式中：C-测定吸光度对应蛋白质的浓度（μg/mL）；

V-定容体积（mL）；

M-移取糖液量（g）；

°Bx-糖液锤度。

2　结果与讨论

2.1标准曲线回归方程建立

以吸光度值为纵坐标，标准蛋白浓度为横坐标作图，得到蛋白质标准曲线如下图1。线性回归方程式Y=0.0032X+0.1319，R2=0.9954，相关系数r=0.9977，表明蛋白质含量在10～100μg/mL范围内很好地符合郎伯-比尔（Lamber-Beer）定律。

图1　蛋白质标准曲线

2.2稳定性实验

移取2ml同一实验样品溶液，加入8ml考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，在40分钟内，在595nm波长下，每隔5min测定1次，观测其稳定性。结果表明，显色时间在10min到30min内吸光度稳定性较好，结果见下图2。

图2　稳定性实验结果

2.3精密度实验

精密移取1mL牛血清蛋白标准溶液，连续6次测定其吸光度，经结果计算得RSD=0.225%，小于5%，表明实验精密度较高，结果见表2。

表2　精密度实验结果

2.4重现性实验

精密移取来自同一批原料的试样，按样品测定方法分别测定其吸光度，经计算得RSD=0.993%，小于5%，表明重复性较好，结果见表3。

表3　重现性实验结果

2.5回收率实验

精密吸取已测定的糖液1.0mL，分别加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL的蛋白质标准溶液，加蒸馏水至2.0ml，按样品测定方法，分别测定其吸光度，计算回收率，结果见表4，样品平均回收率为99.55%，RSD =1.30%，符合实验要求。

表4　回收率实验结果

2.6各工艺段糖物料蛋白质含量测定结果与讨论

采集2014/2015年榨季中期金光、明阳和伶俐三家糖厂生产过程中的糖物料，包括混合汁、澄清汁、粗糖浆、精糖浆以及甲原蜜和乙原蜜。其中混合汁为压榨工段物料，清汁为混合汁澄清后的糖物料，粗糖浆为蒸发后的糖物料，精糖浆为经过糖浆上浮后的物料，甲原蜜、乙原蜜为分蜜工段的中间物料。金光和明阳糖厂采用磷酸亚硫酸法澄清工艺，而伶俐糖厂为碳酸法澄清工艺。将实验测得的蛋白质含量列于表5，为方便比较，作成图3。

表5　各工艺段糖品蛋白质含量　　单位：mg/kg·°Bx

图3　不同澄清工艺制糖生产过程中蛋白质含量差异

从表5和图3可以看出，三个糖厂的混合汁蛋白质含量有较大差异，明阳糖厂含量最高，比伶俐糖厂和明阳糖厂分别高出5.78%、32.62%，造成此现象的原因主要是甘蔗原料的不同，甘蔗原料主要与甘蔗品种、田间管理、病虫害以及新鲜程度等因素有关。对混合汁进行澄清后发现，三个糖厂的清汁蛋白质含量都比较低，说明清净过程蛋白质除去都较好，金光、明阳、伶俐糖厂蛋白质去除率分别达到了94.14%、97.17%和97.86%，这是因为榨季中期甘蔗比较成熟，可溶性蛋白含量较高，分子量较大，而细胞壁离子型结合蛋白和共价型结合蛋白的含量都逐渐降低，使蔗汁中可凝结的蛋白质占比升高，较易除去。比较不同澄清方法的物料发现，采用碳酸法澄清工艺的伶俐糖厂清汁蛋白质含量要低于明阳糖厂和金光糖厂，碳酸法澄清工艺对蛋白除去率高于亚硫酸法，这是因为蛋白质结合的钙量随糖汁中钙离子浓度升高而增大，并随着pH升高而增大，碳酸法澄清添加了大量的石灰，形成碳酸钙沉淀物对物料进行全汁过滤，引入的大量钙离子能与蛋白质充分结合，对蛋白质的充分去除起到很好的作用。

两间亚硫酸法糖厂的物料蛋白质含量也有差异，明阳糖厂在清净过程中蛋白质的除去率要高于金光糖厂，说明明阳糖厂在制糖生产过程的质量控制都要好于金光糖厂；糖浆和原蜜蛋白质含量都呈现相同的趋势，都是伶俐糖厂＜明阳糖厂＜金光糖厂；三家糖厂的精糖浆的蛋白质含量均低于粗糖浆，说明在糖浆上浮过程中，除去了一部分的蛋白质，除去率约为10%～30%。此外，乙原蜜蛋白质含量高于甲原蜜约30%～50%，在分蜜工段越往后面的物料蛋白质含量越高，这是由于蔗糖的结晶使得后续工序物料的杂质累积所致，且从精糖浆到甲原、乙原，蛋白质含量增加的幅度相似。与亚硫酸工艺比较，总体上碳酸法工艺相应的中间物料的蛋白质含量仍然为最低，也说明了碳酸法厂的提糖率和糖产品质量与亚硫酸法比较具有较明显的优势。

3　结论与展望

采用考马斯亮蓝法测定糖汁中的蛋白质含量，在波长为595 nm、反应时间为10～30min内，标准蛋白质溶液浓度在10～100μg/mL之间呈现良好的线性关系，精密度实验、重现性实验、加标回收实验RSD均小于5%。考马斯亮蓝法用于测定甘蔗中蛋白质的含量，具有简便迅速、灵敏度高、重现性好、对设备要求低等特点，适合大量糖汁样品的测定。

澄清工段能除去糖汁大部分的蛋白质，采用碳酸法澄清工艺蛋白质除去率要高于亚硫酸法，后续工段相应的各种糖物料的蛋白质含量也是碳法厂低于亚法厂。由此可见，糖物料中的蛋白质若在澄清工段被去除，对于制糖过程是有积极意义的。而残余在糖物料中的蛋白质却成为造蜜因子，对制糖过程是有害的因素，直接影响到糖品的质量和收回率。制糖工作者可以从源头上思考蛋白质对制糖过程影响的利与弊，通过研究甘蔗品种、各类蛋白质、各种氨基酸、酰胺、胨和多肽对制糖的影响，研究甘蔗蛋白在甘蔗中的含量与甘蔗的品种和质量的关系，研究新鲜成熟的甘蔗与不新鲜或未成熟甘蔗的蛋白质对制糖的影响，还可研究风折、霜冻、虫害等自然灾害甘蔗中的蛋白质对制糖过程的危害。可为甘蔗的种植管理，为糖厂的砍运榨管理，为蔗汁清净和后续工艺管理的优化提供确切有用的依据。

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Two Typical Sugar Manufacturing Process Changes in Protein

WeiHai，Liu Hui-xia，ZhouWen-hong
（Collegeof Light Industry and Food Engineering，GuangxiUniversity，Nanning530004）

Determination of the protein content of each process section two kinds of sugar processmaterials using Coomassie brilliant blue．Experiments show that the absorbance wasmeasured at awavelength of 595nm at the reaction time iswithin 10～30min，standard protein concentration of the solution showed a good linear relationship within the range of 10～100μg/mL，experimental precision，reproducibility experiment，spiked recovery experiments performed well．Carbonation process in the cleaning process for removing sugarmixed juice rate of protein than sulfitation process．Carbonation clarification process better than the sulfitation process．

Sugar craft;Protein;Coomassie brilliant blue

TS244

B

2095-820X（2016）02-06

2016-03-08；

2016-04-20

广西科学基金项目资助（2011GXNSFC018006；桂科转1298009-13）。

韦海（1989-），男，广西宜州人，硕士研究生，研究方向：制糖过程强化理论与技术。Email：Wei202hai＠163．com。通讯作者：刘慧霞，教授。Email：sugarliu＠gxu．edu．cn。