鬼臼毒素衍生物SQW-76诱导人骨肉瘤细胞凋亡及其机制*

魏 兴， 王春江， 曹 波， 孙强稳

(1.包头医学院，内蒙古包头 014060；2.包头市第四医院骨四科；3.武警后勤学院救援医学系生药学教研室)



鬼臼毒素衍生物SQW-76诱导人骨肉瘤细胞凋亡及其机制*

魏 兴1， 王春江2， 曹 波3， 孙强稳3

(1.包头医学院，内蒙古包头 014060；2.包头市第四医院骨四科；3.武警后勤学院救援医学系生药学教研室)

目的：研究鬼臼毒素衍生物SQW-76对人骨肉瘤U-2 OS细胞的抗肿瘤活性并探讨其机制。方法：噻唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)法检测SQW-76及阳性对照药物依托泊苷(VP-16)和阿霉素(adriamycin,ADM)对U-2 OS细胞和成纤维细胞体外增殖的抑制作用及对U-2 OS细胞生长曲线的影响；异硫氰酸荧光素-碘化丙啶(fluorescein isothiocyanate-propidium iodide，FITC-PI)双染行流式细胞术测细胞凋亡；聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测SQW-76对U-2 OS细胞凋亡相关基因表达的影响；caspase总抑制剂及caspase-3抑制剂对SQW-76诱导U-2 OS细胞凋亡的影响；JC-10线粒体膜电位检测法测SQW-76对U-2 OS细胞凋亡线粒体通路的影响；检测Caspase-3蛋白活性。结果：SQW-76在体外对U-2 OS细胞抑制作用明显，IC50值为(6.18±0.3)μmol/L，流式细胞术检测SQW-76通过凋亡途径抑制细胞，PCR发现给药后Caspase-3、caspase-9 mRNA表达水平上调，加入Caspase总抑制剂可明显抑制细胞凋亡，加入Caspase-3抑制剂可轻微抑制细胞凋亡，给药后线粒体膜电位降低，Caspase-3蛋白活性增高。结论：SQW-76在体外试验抗骨肉瘤细胞作用明显且体细胞毒性低于阳性药物VP-16、ADM，其可能通过影响caspase-9、caspase-3相关基因诱导线粒体凋亡通路诱导U-2 OS细胞凋亡。

鬼臼毒素衍生物；骨肉瘤；U-2 OS细胞；细胞凋亡；抗肿瘤

骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤，约占所有骨肿瘤的60 %。骨肉瘤化疗的整体有效率仍在60 %左右，主要原因是化疗药不良反应和肿瘤细胞耐药问题。其他原因包括二线化疗药的缺乏、化疗风险评估、化疗新方案等仍待解决。鬼臼毒素是从小蘖科鬼臼属植物-华鬼臼的根和茎中提取到的木脂类抗肿瘤成分[1]。由鬼臼毒素结构改造所得的衍生物依托泊苷和替尼泊苷已经成为临床上常用的拓扑异构酶II(topoisomerase,Topo II)制剂，在临床上得以广泛应用。但仍存在抗癌谱窄、水溶性差及较严重的骨髓抑制与胃肠道反应等缺点[2]。SQW-76是本课题组对鬼臼毒素结构加以改造所研制的新型化合物。本研究以鬼臼毒素衍生物依托泊苷(VP-16)和临床抗肿瘤药阿霉素(adriamycin,ADM)为阳性对照药，以人骨肉瘤细胞U-2 OS为实验对象进行了一系列研究，探索SQW-76对骨肉瘤细胞的抗肿瘤活性及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 一般材料

1.1.1 细胞株 U-2 OS人骨肉瘤细胞，由中国科学院细胞库提供。成纤维细胞购自凯基生物公司。

1.1.2 药物及试剂 SQW-76，分子量602.87，为鬼臼毒素结构改造获得，由武警后勤学院生药学教研室合成，纯度>95 %。依托泊苷(VP-16)，分子量588.56，为中国药品生物制品检定所标准品，批号：100388-201301。ADM分子量579.99，江苏辉瑞，国药准字H20093251。RPMI-1640(天津百若克)，胎牛血清(中国医学科学院血研所)，溴化四氮唑蓝(Sigma公司)，四甲基乙二胺、Tris Base、Tris HCl、二甲基亚砜购自CotyBioTech公司。Annexin-V Binding Buffer、异硫氰酸荧光素-碘化丙啶(fluorescein isothiocyanate-propidium iodide，FITC-PI)、Annexin-V、Propidium Iodide Solution为美国BioLegend公司产品。Caspase总抑制剂Z-VAD-FMK、Caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO(碧云天)。RT-PCR试剂盒(大连宝生物资源有限公司)。JC-10细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒(南京凯基)，Caspase-3活性检测试剂盒(碧云天)。

1.2 方法[2]

1.2.1 细胞培养 人骨肉瘤细胞U-2 OS，人成纤维细胞在RPMI-1640培养基中(含10 %胎牛血清，100 kU/L青霉素、100 mg/L链霉素)培养。

1.2.2 MTT法测SQW-76对U-2 OS的抗肿瘤活性：人骨肉瘤细胞U-2 OS细胞，取对数生长期细胞接种于96孔板内，每孔约8 000个细胞，置于37 ℃，5 %CO2孵箱内培养。24 h后加入不同浓度的阳性对照药ADM、VP-16和鬼臼毒素衍生物SQW-76(终浓度10、1、0.1、0.01 μmol/L)，每个浓度组设3复孔，另设阴性对照组加入与给药组等体积的培养液。放入孵箱中培养后加MTT，37 ℃培养4 h后，弃上清加二甲基亚矾150 μL，测定490 nm光密度值，计算IC50值。

1.2.3 Hoechst33342/PI/Annexin V-FITC染色 U-2 OS细胞接种96孔板并分浓度梯度给药后48 h，用Hoechst33342/PI/Annexin V-FITC染色来观察给药后细胞形态变化及细胞凋亡情况。Hoechst33342(终浓度10 μg/mL)，染色5～10 min，PBS洗涤后加入Annexin V-FITC(终浓度10 μg/mL)、PI(终浓度10 μg/mL)，染色5 min，PBS洗涤后加入PBS 100μL，用GE In Cell Analyzer 2000高内涵细胞成像分析系统观察并分析。

1.2.4 流式细胞仪侧SQW-76对U-2 OS细胞凋亡的影响 U-2 OS细胞接种于6孔板内，24 h后分别加入SQW-76(终浓度4,6,8 μmol/L)及ADM和VP-16(终浓度6 μmol/L)，对照组加入等量培养基，48 h后收集细胞，Annexin V-FITC/PI双染后室温孵育30 min，流式细胞仪测定细胞凋亡。

1.2.5 噻唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)法测caspase-3抑制剂和caspase总抑制剂合并SQW-76对U-2 OS细胞的影响 取对数生长期U-2 OS细胞接种于96孔板内，24 h后分3组，分别加入caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO(终浓度20 μM)、caspase总抑制剂Z-VAD-FMK(终浓度20 μM)和等量培养基孵育30 min，然后3组均加入SQW-76(终浓度4、6、8 μmol/L),对照组加入等量培养基。48 h后用MTT法测吸光度值，并观察caspase-3、caspase总抑制剂对SQW-76的影响。

1.2.6 SQW-76对U-2 OS细胞基因的影响 对数生长期细胞接种于6孔细胞培养板，接种24 h后，分别加入SQW-76(终浓度4、6、8 μmol/L)及对照药VP-16和ADM(终浓度6 μmol/L)，48 h后收集细胞，用Biozol法提取总RNA，RCR分析：β-actin作为内标，目的基因caspase-3(引物序列F:5'-TGGCATTGAGACAGACA-3'，R:5'-GGCACAAAGCGACTG-3')、caspase-9(引物序列F: AGACCAGAGATTCGCAAAC-3'，R:5'-TTCCTGGAACGGGGTGGCAT-3')、caspase-8(引物序列F:5'-CCAGAGACTCCAGGAAAAGAGA-3'，R:5'-GATAGAGCATGACCCTGTAGGC-3')，产物1.5 %琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.7 JC-10线粒体膜电位检测试剂盒检测SQW-76对U-2 OS细胞的影响 U-2 OS细胞接种24h后给SQW-76(终浓度4、6、8 μmol/L)和ADM、VP-16(终浓度6 μmol/L)，48 h收集细胞，JC-10染液37 ℃孵育30 min后用磷酸盐缓冲液洗涤，通过TS100型倒置显微镜观察及Olympus数码相机照相，并用流式细胞仪检测吸光度。

1.2.8 Caspase-3活性检测试剂盒检测SQW-76给药后的活性：取对数生长期U-2 OS细胞接种于6孔板24 h后给药SQW-76(终浓度4、6、8 μmol/L)和ADM、VP-16(终浓度6 μmol/L)，收集细胞后加入裂解液，冰浴裂解15 min，4 ℃ 16 000-20 000 g离心10～15 min，把上清转移到冰浴预冷的离心管中，测定caspase 3的酶活性，待测样本加Ac-DEVD-pNA(2 mM)，37 ℃孵育120 min，酶标仪测定A405。

1.3 统计学分析 实验数据用均数±标准差表示，采用SPSS11.0统计软件分析数据。

2 结果

2.1 MTT法测SQW-76对U-2 OS的抗肿瘤活性 SQW-76对U-2 OS细胞的IC50值为(6.18±0.3)μmol/L，接近阳性药VP-16(4.72±0.41)μmol/L和ADM(2.64±0.21)μmol/L。

2.2 SQW-76对U-2 OS细胞形态的影响 Hoechst33342是一种可以穿过细胞膜的细胞核染料，呈蓝色荧光。PI能通过细胞膜受损的细胞进行细胞核染色，呈红色荧光。Annexin V-FITC可与凋亡早期细胞膜结合，呈绿色荧光。因此，正常细胞Hoechst33342(+)/PI(-)/Annexin V-FITC(-)，凋亡早期细胞Hoechs/PI(-)/Annexin Hoechst33342(+)/PI(-)/Annexin V-FITC(+)，凋亡晚期细胞Hoechst33342(+)/PI(+)/AnnexinV-FITC(+)。通过Hoechst 33342、PI、Annexin V-FITC染色可以明显观测到U-2 OS细胞的凋亡情况。并且，随着SQW-76浓度的增加，细胞凋亡程度更加明显，见图1。

组别U-2OS细胞凋亡抑制率(%)U-2OS+Caspase总抑制剂细胞凋亡抑制率(%)U-2OS+Caspase-3抑制剂细胞凋亡抑制率(%)SQW-76(4μmol/L)17.717.26a12.48SQW-76(6μmol/L)47.612.48b38.22aSQW-76(8μmol/L)71.4631.72b67.52

a为与U-2 OS组比较P<0.05，b为与U-2 OS组比较P<0.01

2.5 SQW-76对凋亡相关基因caspase-3、8、9 mRNA的影响 在发现Caspase总抑制剂可以抑制SQW-76的药效后，检测了了凋亡相关基因Caspase-3、8、9的基因表达。SQW-76作用于U-2 OS细胞24 h后，发现caspase-3、9的表达量有所增高，且随着给药浓度的提caspase-3、9的表达量也相应升高，Caspase-8表达量无明显变化，见图3、图4。

2.7 检测SQW-76给药后Caspase-3活性 SQW-76给药后U-2 OS细胞线粒体膜电位下降提示细胞凋亡与线粒体通路相关，所以检测线粒体通路下游凋亡“执行者”Caspase-3的活性，结果发现6 μmol/L时，Caspase-3活性升高。结果见表4。

表3 不同样品JC-10染色后流式细胞仪吸光度平均值

a为与正常细胞比较P<0.05；b为与正常细胞比较P<0.01

正常细胞SQW-76M(6μmol/L)ADM(6μmol/L)VP-16(6μmol/L)Caspase-30.104±0.0030.158±0.006a0.06±0.005a0.121±0.003a

a为与正常细胞比较P<0.01

3 讨论

SQW-76是以鬼臼毒素为基础合成的一种新型化合物。本研究中，MTT实验结果可见，SQW-76对U-2 OS细胞抑制作用明显。给药后48 h半数致死量IC50为6.18 μmol/L，与阳性对照药ADM、VP-16较接近。

SQW-76给药后U-2 OS细胞形态出现了明显改变，本研究通过Hoechst33342/PI/Annexin V-FITC三染后观察发现SQW-76作用于U-2 OS细胞后，细胞出现皱缩、变形、碎裂、胞浆浓缩、核固缩、出现凋亡小体。并且高浓度给药后，PI高染、Annexin V高染细胞明显增多，提示给药后细胞增殖抑制作用明显，并且可能与诱导细胞凋亡相关。流式细胞仪检测低、中、高浓度SQW-76作用于U-2 OS细胞48 h后，凋亡细胞比例明显增加，主要集中在凋亡晚期，随给药浓度的增加，凋亡细胞数目增加，说明SQW-76通过诱导凋亡抑制细胞增殖。

细胞凋亡途径包括利用细胞表面死亡受体的外源性途径和线粒体、内质网相关内源性途径，即3条通路：死亡受体通路，线粒体通路，内质网通路[3]。凋亡相关基因Caspase家族与这3条通路密切相关，Caspase-8与死亡受体通路相关，Caspase-9与内质网通路、线粒体通路相关，3条通路均可诱导Caspase-3活性增高启动细胞凋亡。通过MTT法发现，加入Caspase总抑制剂或Caspase-3抑制剂后，SQW-76对U-2 OS细胞的抑制率出现了改变，加入Caspase总抑制剂后细胞抑制率明显下降，加入Caspase-3抑制剂后细胞抑制率轻微下降。提示SQW-76诱导U-2 OS细胞凋亡可能与Caspase家族相关，本研究运用RT-PCR法分析了不同浓度给药后24 h细胞Caspase-3、Caspase8、Caspase9 mRNA的表达，结果显示随着给药浓度的增加，Caspase-3、9的表达量也增高，而Caspase-8的表达量变化不明显。这一结果提示SQW-76诱导细胞凋亡可能与Caspase-9相关的线粒体通路或内质网通路相关，与Caspase-8相关的死亡受体通路可能无关。

细胞凋亡途径中线粒体通路最早发生的事件是线粒体跨膜电位的破坏，我们使用JC-10细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒检测不同浓度SQW-76对U-2 OS细胞给药后24h细胞线粒体膜电位的改变。JC-10可以选择性进入线粒体，在膜电位下降时，JC-10从橙绿色变为绿色。荧光显微镜观察时，正常细胞为高绿高红，凋亡细胞为高绿低红。用流式细胞仪分析时，红色荧光通常通过FL-2通道来检测，正常细胞(FL-1高，FL-2高)，凋亡细胞(FL-1高，FL-2低)。本研究发现，荧光显微镜可见正常U-2 OS细胞呈高绿高红，不同浓度SQW-76给药后，随给药浓度的增加，细胞逐渐变为高绿低红表现，阳性药ADM给药后细胞变为高绿低红，与文献一致[4]。流式细胞仪检测发现，随给药浓度的增高，FL-2吸光度降低。结果提示SQW-76给药后，U-2 OS细胞线粒体膜电位随给药浓度升高而降低，SQW-76诱导细胞凋亡与线粒体通路相关。Caspase-3活性检测结果显示SQW-76浓度为6 μmol/L(IC50)时，Caspase-3活性显著升高，与应用caspase-3抑制剂后细胞抑制率下降相符。

综上所述，SQW-76在体外试验抗骨肉瘤细胞作用明显且体细胞毒性低于阳性药物VP-16、ADM，其可能通过影响caspase-9、caspase-3相关基因诱导线粒体凋亡通路诱导U-2 OS细胞凋亡。可将SQW-76进一步应用于抗骨肉瘤药物的研究中，为研发新的抗肿瘤药物提供实验基础。

[1] Zeze Fu,Biyong Deng,Yuxin Liao,et al.The anti-tumor effect of shikonin on steosarcoma by inducing RIP1 and RIP3 dependent necroptosis[J].BMC Cancer,2013,13:580-590.

[2] 冯欲静，牛聪，曹波,等.鬼臼毒素衍生物NY-3诱导HeLa细胞凋亡及其机制探究[J].武警后勤学院学报(医学版),2014,23(1):9-12,17.

[3] Dai C,Xiao X,Tang S，et al.Colistin-induced nephrotoxicity in mice involves the mitochondrial,death receptor,and endoplasmic reticulum pathways[J].Antimicrob Agents Chemother,2014,58(7):4075-4085.

[4] He M,Sun HG,Hao JY,et al.RNA interference-mediated FANCF silencing sensitizes OVCAR3 ovarian cancer cells to adriamycin through increased adriamycin-induced apoptosis dependent on JNK activation[J].Oncol Rep,2013,29(5):1721-1729.

Exploration on the induction of apoptosis on human osteosarcoma cells by podophyllotoxin derivate SQW-76 and its mechanism

WEI Xing1, WANG Chunjiang2, CAO Bo3, SUN Qiangwen3

(1.BaotouMedicalCollege,Baotou014040,China; 2.TheFourthHospitalofBaotou,Baotou014030,China; 3.TeachingandResearchSectionofPharmacognosyinDepartmentofRescueMedicine,LogisticsUniversityofPeople'sArmedPoliceForces,Tianjin300309,China)

Objective:To investigate the antitumor activity of podophyllotoxin derivatives SQW-76 on human osteosarcoma U-2 OS cells and its mechanism.Methods：The inhibition of U-2 OS cell and fibroblast cell proliferation and the growth curve of U-2 OS cells by SQW-76 and positive control drug etoposide (VP-16) and adriamycin (ADM) in vitro was determined by methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide(MTT)assay. Fluorescein isothiocyanate-propidium iodide (FITC-PI) double staining for apoptosis was measured by flow cytometry. Polymerase chain reaction (PCR)was determined to detect the effect of SQW-76 on expression of genes related to apoptosis in U-2 OS cells. The effect of caspase total inhibitor and caspase-3 inhibitor on SQW-76 induced apoptosis in U-2 OS cells was evaluated; the effects of SQW-76 on apoptosis of U-2 OS cell mitochondrial pathway by JC-10 mitochondrial membrane potential detection method were measured; Caspase-3 protein activity was detected.Results：SQW-76 inhibited the proliferation of U-2 OS cells in vitro significantly. The value of IC50 was (6.18 + 0.3) mol/L. SQW-76 inhibited U-2 OS cells through apoptosis, which was detected by flow cytometry; SQW-76 was found to upregulate the expression of Caspase-3, 9 mRNA by PCR; Caspase total inhibitor and Caspase-3 inhibitor could inhibit U-2 OS cell apoptosis induced by SQW-76; The mitochondrial membrane potential of U-2 OS reduced after SQW-76 treatment; Caspase-3 protein activity increased after SQW-76 treatment. Conclusion：SQW-76 can inhibit osteosarcoma cells in vitro significantly. The toxicity somatic cell of SQW-76 is lower than the positive drug VP-16 and ADM, which may influence the caspase-9 and caspase-3 gene through mitochondrial apoptosis pathway induced apoptosis in U-2 OS cells.

Podophyllotoxin derivatives; Osteosarcoma; U-2 OS cells; Apoptosis; Antitumor

国家自然科学基金资助项目(30873363)

王春江，曹 波

2015-08-26)