大熊猫慢性营养不良综合征病因学研究

王成东 Carlos Sanchez 罗 娌 兰景超 李明喜 黄详明杨 智 刘 礼 黄文俊 吴孔菊 杨光友 颜其贵

(1.成都大熊猫繁育研究基地，成都，610081；2.华盛顿国家动物园，华盛顿；3.四川农业大学，雅安，625014)

大熊猫慢性营养不良综合征病因学研究

王成东1Carlos Sanchez2罗 娌1兰景超1李明喜1黄详明1杨 智1刘 礼1黄文俊1吴孔菊1杨光友3颜其贵3

(1.成都大熊猫繁育研究基地，成都，610081；2.华盛顿国家动物园，华盛顿；3.四川农业大学，雅安，625014)

大熊猫；

(1.Chengdu Research Base of Giant Panda Breeding，Chengdu ，610081，China；2.The National Zoological Garden，Washington，D.C.，USA；3.Sichuan Agricultural Unversity，Yaan，625014，China)

圈养条件下，大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)慢性营养不良综合征(Stunted Development Syndrome，SDS)是一种发病率极高、病因病原不明、难以预防与治愈的全球性疑难病症，其发病致死率占大熊猫圈养种群总死亡率的37.5%[1]。特别是处于生长发育阶段的亚成体大熊猫，一旦发生该病，极容易变成僵猫、失去繁殖能力，最终死亡[1-5]。该病的主要临床特征是消瘦、被毛粗乱无光泽、食欲时好时坏、排黏频繁(4～10次/月)且持续时间长、体重增长缓慢或不增长，更为严重者出现腹水、低蛋白血症等。由于病因学不清，该病在临床治疗上除一般性对症支持治疗外别无他法，即使偶尔有一定效果，但无法从根本上治愈[1-7]，给圈养大熊猫繁育与种群壮大造成了极其严重的危害。为了探讨该病的发病原因，本研究特从血液学、寄生虫学、细菌学、病毒学和病理组织学领域开展了大熊猫慢性营养不良综合征病因学探索，旨在为该病的临床治疗和预防提供确实的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

4只患慢性营养不良综合征的大熊猫均来自成都大熊猫繁育研究基地大熊猫种群，年龄和体重为2005年时数据，具体临床资料见表1。

表1 4只患慢性营养不良大熊猫个体基本临床资料

Tab.1 Clinical datas of four giant pandas sufferring from SDS

1.2 慢性营养不良综合征判定标准

同时符合以下标准的大熊猫个体被诊断为慢性营养不良综合征[5]。

1.2.1 外观

食欲时好时坏、体形消瘦、被毛粗乱无光泽、腹围增大或伴有波动感，排黏频繁(>4次/月)(图1)

图1 患慢性营养不良综合征大熊猫个体Fig.1 Giant panda characterized by stunted development syndrome

1.2.2 体形

与同龄个体相比，体形明显瘦小；成年雄性个体体重低于100 kg，成年雌性个体体重低于80 kg。

1.2.3 繁殖能力

与实际年龄相比生殖器发育不成熟；雌性个体不发情、发情行为紊乱或偶尔受孕产畸形胎儿；雄性个体繁殖季节无性欲、采不出精液或者偶尔采出精液但精液质量无法满足繁殖需要。

1.3 仪器

内窥镜(日本Olympus生产)、B超机(荷兰PMI生产)、MATRX麻醉机(美国Midmark生产)。

1.4 动物麻醉

5%的盐酸氯胺酮按8～10 mg/kg体重麻醉保定后，用Isoflurane进行气管插管麻醉。

1.5 血液常规与生化

非麻醉无干扰条件下，每月采集4只患病大熊猫外周血液进行血液常规和生化检查，持续检查1 a。

1.6 病原学检查

1.6.1 细菌的分离鉴定

1.6.1.1 标本

4只患病大熊猫粪便、肛拭子、血液。

1.6.1.2 分离培养

将标本接种于CEM增菌液中，在42℃含有85% N2、10% CO2和5% O2的微需氧条件下，培养12 h后再移种于Campy BAP血琼脂平板上培养48 h后观察结果；将标本增菌后分别接种与S-S、EMB琼脂及血平板和庖肉培养基中，分别置于需氧、厌氧(37℃)培养24～48 h观察结果。

1.6.2 寄生虫检查

1.6.2.1 寄生虫虫卵或卵囊检查

定期收集每只大熊猫粪便，通过循序沉淀法、漂浮法、改良抗酸染色法并结合PCR方法[8-9]等进行寄生虫虫卵或卵囊检查。

1.6.2.2 犬恶丝虫检查

定期采集每只大熊猫血液，采用改良柯氏试验(Knott’s test)进行犬恶丝虫(Dirofilariaimmitis)微丝蚴检查和ELISA方法进行犬恶丝虫抗原的检测[9]。

1.6.3 病毒病原学检查

1.6.3.1 犬瘟热病毒RT- PCR 扩增

参照文献[10]进行操作，即采用10 μL体系：RNA 模板7 μL，5×PrimeScritTM缓冲液2 μL，RT Enzyme Mix 0.5 μL，Random 6 mers 0.5 μL，反转录反应条件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保存；PCR反应体系为：10 μL 2×TaqPCR Master Mix，6 μL灭菌双蒸水，3 μL反转录模板，各0.5 μL上下游特异引物；PCR循环参数为：95℃预变性5 min；95℃循环变性30 s，54℃退火复性30 s，72℃延伸30 s，循环次数为30次；72℃延伸10 min，取扩增产物于10 g/L琼脂糖凝胶电泳，并观察结果。

1.6.3.2 犬细小病毒PCR扩增

参照文献[11]进行操作，PCR反应体系为：10 μL 2×TaqPCR Master Mix，7 μL灭菌双蒸水，2 μL模板，上下游引物各0.5 μL。0.5反应参数为：95℃预变性 5 min；95℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 30 s，循环30次；72℃延伸10 min。取10 μL扩增产物于10 g/L 琼脂糖凝胶电泳，并观察结果。

1.7 病理组织学检查

内窥镜活剪钳钳取患病动物结肠可疑病变组织3～4块，常规福尔马林固定后进行病理组织学观察。

2 结果

2.1 血液学检查

4只受检大熊猫连续1 a的血液常规和生化检查结果(表2)显示：除贫血、低蛋白血症、低血钙、高血磷、血清Ca/P明显倒置外，血液中性粒细胞下降、淋巴细胞升高，尤其是嗜酸性粒细胞(Eosinophil)显著升高(8%～30%)，呈现典型的嗜酸性粒细胞血症[12](Eosinophilia)。

表2 4只患病大熊猫个体2005～2006年度血液学检查结果

Tab.2 CBC and blood chemistry of 3 giant pandas sufferring from SDS from 2005 to 2006

2.2 病原学检查

2.2.1 寄生虫学检查

通过沉淀法和漂浮法检查，4只患病大熊猫除偶有大熊猫蛔虫卵检出外，未见其他寄生虫虫卵；通过改良抗酸染色法并结合PCR方法检查，4只患病大熊猫粪便中未发现隐孢子虫(Cryptosporidium)；通过血液涂片检查，所有大熊猫血液中未发现犬恶丝虫微丝蚴，通过ELISA抗原快速检查，所有大熊猫血液样品的犬恶丝虫抗原呈阴性。

2.2.2 细菌学检查

研究期间，除1#大熊猫急性腹泻伴红色黏液便和2#大熊猫急性腹泻伴严重血尿症时分离出一株致病性克雷伯氏杆菌外[13]，所有样品在需氧和厌氧培养基中均未检出致病性大肠杆菌和沙门氏菌；在微需氧培养基中未检出弯曲杆菌。

2.2.3 病毒学检查

通过对犬瘟热病毒和细小病毒PCR扩增，结果显示为阴性(图2，图3)。

2.2.4 结肠病理组织学观察

结肠黏膜上皮结构正常，多量黏液分泌(图4，图5)；固有层水肿，细胞较正常减少，几乎无法看到正常状态所见中性粒细胞和淋巴细胞，淋巴管扩张，管腔内有很多黏液，肠腺大小正常、腺上皮较为完整(图6)，但黏膜固有层内结缔组织增生(图7)。

图2 患病大熊猫犬瘟热病毒RT-PCR扩增Fig.2 Results of CDV PCR amplifications of 4 giant pandasM：DL500 DNA Marker；阴：阴性对照；阳：阳性对照；1～4：4只患病大熊猫粪便样品M：DL500 DNA Marker；neg：negative control；pos：positive control；1-4：fecal samples for 4 giant pandas

图3 患病大熊猫细小病毒PCR扩增Fig.3 Results of parvovirus PCR amplifications of 4 giant pandasM：DL500 DNA Marker；阴：阴性对照；阳：阳性对照；1～4：4只患病大熊猫粪便样品M：DL500 DNA Marker；neg：negative control；pos：positive control；1-4：fecal samples for 4 giant pandas

图4 结肠黏膜上皮结构正常，多量黏液分泌 HE X 400Fig.4 The colonic mucosa epithelia seems intact and a lot of mucus secretion，HE x 400

图5 结肠黏膜上皮结构正常，多量黏液分泌固有层炎症细胞减少HE X 400Fig.5 The colonic mucosa epithelia seems intact and a lot of mucus secretion；the lamina propria has not enough inflammatory cells，HE x 400

图6 结肠固有层淋巴管扩张，淋巴管内多量黏液，肠腺大小正常，腺上皮完整，炎症细胞减少HE x 200Fig.6 The colonic lamina propria lymphatics were dilated, and there was a lot of mucus in the lumen;the glands seem to be of normal diameter and the epithelium seems intact，and not enough inflammatory cells in lamina propria，HE x 200

图7 结肠固有膜结缔组织增生 HE x 200Fig.7 A lot of connective tissue showed in the colonic lamina propria，HE x 200

3 病因学分析

3.1 寄生虫学

寄生虫检查结果表明，患病动物所出现嗜酸性粒细胞血症与寄生虫感染无明显相关性。

3.2 细菌学检查

除1#和2#大熊猫试验期间因急性红色黏液便和血尿症时分离出1株致病性克雷伯氏杆菌外，未检出其他细菌性病原。这一结果表明，患病动物免疫力低下，容易发生条件致病菌感染。

3.3 病毒学检查

病毒PCR扩增检查结果显示，大熊猫慢性营养不良综合征与犬瘟热病毒和细小病毒无相关性。

3.4 病理组织学

患病动物结肠黏膜病理组织学结果提示：动物极可能受到某种不利因素的长期影响，致结肠黏膜固有层炎性细胞明显减少，而无法抵抗外来病原入侵，作为一种代偿性机制反应，结肠黏膜淋巴管大量黏液的出现是为快速冲刷外来入侵病原，最后导致结肠黏膜固有层大量结缔组织堆积。

4 讨论

4.1 大熊猫慢性营养不良综合征病因学研究现状

早在1982年，伦敦动物园曾报道过1只慢性营养不良综合征雌性成年大熊猫的临床表现与治疗措施，并通过免疫学方法检测发现该大熊猫个体的发病与食物中的卵清蛋白(Albumin)高度相关，最后通过取消食物中的鸡蛋成分，该患病大熊猫的健康得到明显改善[14-15]。张金国等报道，2只患慢性营养不良综合征的亚成年大熊猫血液中三碘甲状腺原氨酸(T3)明显低于同龄健康大熊猫，并采用口服甲状腺激素治疗后取得了一定的治疗效果，认为大熊猫的慢性营养不良综合征病与低T3综合征相关[3]。余建秋等对9只患该病的大熊猫通过包括病原学、血液学和毛发微量元素测定结果显示，患病动物除表现为低蛋白血症外，最明显的表现为毛发中Cu、Zn、Mn等微量元素含量极显著低于健康大熊猫，通过中西医对症治疗取得了一定的效果[4]。张成林等通过对4只患病大熊猫的血液学资料、死亡个体病理组织学和临床表现等综合分析后认为，消化吸收障碍是引起大熊猫发生营养不良综合征的发病原因[7]。因此，虽然国内外专家从不同领域对该病的发病原因进行了探索与研究，但至今也未明确该病的发病原因并找到有效的防治措施。

4.2 大熊猫慢性营养不良综合征与日粮中动物源性蛋白质的相关性

本研究通过对4只患病个体连续1 a的血液学、细菌学、病毒学和寄生虫学检查结果表明，患病大熊猫除表现为典型的嗜酸性粒细胞血症外，并未发现其他可疑的细菌性病原、病毒性病原和寄生虫病原。在排除寄生虫感染的前提下，患病动物长期处于高嗜酸性粒细胞血症已经提示动物极可能受到过敏原刺激处于过敏状态。尽管圈养大熊猫的排黏被认为是一种正常的生理性反应，但野外大熊猫生态学调查至今都未见有排黏报道[16]，而患慢性营养不良综合征大熊猫高频率的排黏反应也间接说明对圈养条件下的饲养管理存在某种程度的不适。大熊猫消化系统从解剖结构上看属于食肉动物，但由于长期的进化和演变，该物种的食性特点已经演化成以竹子为主食的草食性动物[17]。野外研究证明，大熊猫野生幼兽在1.5岁前主要食物是母乳和竹子，1.5岁后开始离开母兽进行独立生活则完全以竹子为主食[18]。但在圈养条件下，因为担心大熊猫所摄取的营养不足通常都给圈养大熊猫添加富含动物源性的蛋白质(如鸡蛋、牛奶或牛肉)的窝头，且这种饲养管理模式一直贯穿圈养大熊猫的一生，这显然与野生大熊猫的食性特点相背离。而患病动物结肠黏膜病理组织学检查结果显示：动物极可能受到了某种不明因素的长期影响，导致结肠黏膜固有层炎性细胞出现明显减少而无法抵抗外来病原入侵，作为一种代偿性机制反应，动物结肠黏膜淋巴管大量黏液的出现是为快速冲刷外来入侵病原，最后导致结肠黏膜固有层大量结缔组织堆积。根据病理组织学观察结果、血液嗜酸性粒细胞血症特点并结合野生大熊猫的食性，推断圈养大熊猫慢性营养不良综合征的发病原因极可能与日粮中动物源性蛋白直接相关。这一推断与伦敦动物园通过免疫学方法检测的结果高度吻合[14]。成都大熊猫繁育研究基地根据这一原理，通过取消传统大熊猫日粮中动物源性蛋白质并给予脱敏治疗，先后成功治疗了成都大熊猫种群中8只患病个体，治愈率达到100%(另文报道)，取得了极显著的临床效果，也间接证明了这一推断。

[1] 张金国.大熊猫常见疾病的防治概况[C]//成都国际大熊猫保护学术研讨会论文集.成都：四川科技出版社，1994：359-366.

[2] 丁培琳，杨中林，刘颂达，等.大熊猫一胎二仔慢性腹泻并发重度贫血的中西医结合诊治[C]//成都国际大熊猫保护学术研讨会论文集.成都：四川科技出版社，1994：301-304.

[3] 张金国，张成林.大熊猫营养不良研究[C]//成都国际大熊猫保护学术研讨会论文集.成都：四川科技出版社，1998：221-224.

[4] 余建秋，叶智勇，李光汉.大熊猫慢性胃肠炎研究[C]//成都国际大熊猫保护学术研讨会论文集.成都：四川科技出版社，1998：228-233.

[5] Wildt D E，Zhang A，Zhang H，et al.Giant pandas[M].Cambridge：Cambridge University Press，2006：37-99.

[6] 王成东，王强，牛李丽.亚成体大熊猫顽固性胃肠功能紊乱伴严重厌食治疗[C]//成都国际大熊猫保护学术研讨会论文集.成都：四川科技出版社，1998：225-227.

[7] 张成林，夏茂华，杨明海，等.圈养大熊猫营养不良综合征研究[J].野生动物学报，2014，35(3)：271-276.

[8] 杨光友，张志和.野生动物寄生虫病学[M].北京：科学出版社，2013.

[9] Wang T，Chen Z，Xie Y，et al.Prevalence and molecular characterization ofCryptosporidiumin giant panda(Ailuropodamelanoleuca)in Sichuan province，China[J].Parasites &Vectors，2015，8：344.

[10] 郭玲，万莉，马磊，等.犬瘟热病毒RT-PCR检测方法的建立[J].中国兽医科学，2012，42(2)：166-170.

[11] 郭玲，杨绍林，张志和，等.犬细小病毒PCR诊断方法的建立及对大熊猫粪便的检测[J].中国兽医学报，2013，33(8)：1201-1205.

[12] 陈灏珠.实用内科学：下册[M].10版.北京：人民卫生出版社，1997：1934-1936.

[13] 王成东，杨智，兰景超，等.大熊猫致病性催产克雷伯菌的分离鉴定[J].动物医学进展，2006，27(5)：75-76.

[14] Knight J，Brostoff J，Pack S，et al.A possible allergic illness in a giant panda[J].The Lancet,1982，320(8313)：1450-1451.

[15] Frape D L，Cash R S，Ricketts S W.Panda food allergy[J].The Lancet，1983，321(8329)：870-871.

[16] 朱本仁，郭伟.圈养大熊猫排粘与食竹量关系的初步研究[J].动物学杂志，1999，34(4)：35-37.

[17] 张志和，魏辅文.大熊猫迁地保护理论与实践[M].北京：科学出版社，2006：57-131.

[18] 胡锦矗，Schaller G B，潘文石.卧龙的大熊猫[M].成都：四川科学技术出版社，1985：1-225.

Giant panda(Ailuropodamelanoleuca)；

Etiology of the Stunted Development Syndrome of Giant Panda

Wang Chengdong1Carlos Sanchez2Luo Li1Lan Jingchao1Li Mingxi1Huang Xiangming1Yang Zhi1Liu Li1Huang Wenjun1Wu Kongju1Yang Guangyou3Yan Qigui3

We sampled blood，feces and colonic mucousa from four giant pandas(Ailuropodamelanoleuca)sufferring from stunted development syndrome(or chronic malnutrition)for etiological research.We analyzed hematology，bacteriology，virology，parasitology and histological pathology to discover the pathogenesis.We documented eosinophilia in all four individuals.No pathogenic evidence related to bacteria，canine distemper virus，parvovirus，or parasites.Histopathology of the colonic mucusa revealed fewer neutrophils and lymphocytes in the lamina propria than expected.The lymphatics were dilated superficially，indicating edema，and there was abundant mucus in the lumen.The glands were of normal diameters and the epithelia were intact.There was a lotof connective tissue in the lamina propria.We concluded that the reason for stunted development syndrome of giant panda was related to the animal-origin protein from concentrated food combined with the giant panda diet in the wild.

稿件运行过程

2016-04-28

修回日期：2016-05-31

发表日期：2016-11-10

慢性营养不良；

病因学

The stunted development syndrome；

Etiology

S858.9

A

2310-1490(2016)04-301-06

采集4只患慢性营养不良综合征大熊猫的血液、粪便和结肠黏膜分别开展包括血液学、细菌学、病毒学、寄生虫学和病理组织学领域的检测，旨在找到大熊猫慢性营养不良综合征的发病原因。研究结果显示：(1)明显的嗜酸性粒细胞血症(4/4)；(2)未检出相关致病性病原；(3)结肠黏膜病理组织学检查：黏膜固有层几乎无法看到正常状态所见中性粒细胞和淋巴细胞，淋巴管明显增大且淋巴管内有很多黏液，黏膜上皮完整、肠腺大小未见改变，黏膜固有层大量结缔组织增生。据血液学、病原学和结肠黏膜病理组织学检查结果，并结合野生大熊猫食性特点和圈养大熊猫人工精饲料的配方组成，推断大熊猫慢性营养不良综合征与人工精饲料中的动物性蛋白质密切相关。

成都大熊猫繁育研究基金会资助(编号：CPF08011)

王成东，男，51岁，研究员；主要从事大熊猫兽医学研究。E-mail：wcdsyy@sina.com