狗獾东北亚种卵巢卵泡的超微结构研究

王 素 葛艳艳 王冠群 刘玉堂*

(1.东北林业大学野生动物资源学院，哈尔滨，150040；2.庄河市第五高级中学，大连，116413)

狗獾东北亚种卵巢卵泡的超微结构研究

王 素1葛艳艳2王冠群1刘玉堂1*

(1.东北林业大学野生动物资源学院，哈尔滨，150040；2.庄河市第五高级中学，大连，116413)

狗獾东北亚种；

(1.College of Wildlife Resources，Northeast Forestry University，Harbin，150040，China；2.Zhuanghe Fifth Senior High School，Dalian，116413，China)

狗獾(Melesmeles)隶属于食肉目(Carnivora)鼬科(Mustelidae)，是一种兼具延迟着床和半冬眠特征的中型穴居动物，并于2000年8月1日入选国家林业局发布的《国家保护的有益的或者有重要经济、科学研究价值的陆生野生动物名录》。近年来，由于人们的捕杀和栖息地的破坏导致狗獾数量锐减。目前关于狗獾的研究主要涉及行为[1-3]、生态[4-5]、饲养[6-8]等，同时关于狗獾的繁殖期有了新的进展，有研究证明狗獾东北亚种的繁殖交配期是在4～6月，不同于以往的报道[3，8]，但关于狗獾卵巢卵泡的超微结构研究尚未见报道。本实验通过透射电镜对4～6月的狗獾东北亚种(Melesmelesamurensis)卵巢卵泡的超微结构进行观察，探究其卵泡的发育规律，为狗獾的生殖生理及其胚胎工程提供基础资料。

1 材料和方法

1.1 试验材料

2012年4～6月，在狗獾交配期选黑龙江省双鸭山市饶河脉动珍稀动物繁育有限公司饲养场取2年龄以上刚刚成功完成交配的健康雌性成年狗獾的卵巢，按常规方法处理，先后制成卵巢皮质包埋块、经半薄切片对卵泡分类和卵母细胞定位后用超薄切片机切成厚度在50 nm左右的切片，染色后透射电镜观察、记录并照相。

1.2 卵泡细胞的分类

在本实验中，我们参照水貂(Mustelavison)卵泡分类方法[9]，将卵泡按照直径大小、卵泡细胞的层数、透明带的情况、卵泡腔是否出现分为4个阶段。第Ⅰ阶段：卵母细胞由单层扁平卵泡细胞围绕，分布于皮质的浅层；第Ⅱ阶段：卵母细胞由立方状卵泡细胞围绕，卵泡细胞与卵母细胞之间出现裂隙；第Ⅲ阶段：卵母细胞由两至数层卵泡细胞围绕，卵泡膜清晰，形成完整的透明带；第Ⅳ阶段：卵母细胞由多层卵泡细胞围绕，卵泡膜增厚，透明带增厚，出现大的卵泡腔，并出现卵丘。

2 结果

2.1 第Ⅰ阶段

卵母细胞为圆形或椭圆形，中央有一个大而圆的均质核。细胞器大多分布于质膜下的皮质区。线粒体丰富，多为圆形，嵴较少，单个或成群的分布于细胞质中。粗面内质网丰富，可见与线粒体相伴。高尔基体由扁平囊和小泡构成，位于近质膜的皮质区，凹面朝向质膜。偶见皮质颗粒。脂滴数量较多，大小不一，呈嗜锇性深染(图1)。此时期卵泡细胞为单层扁平细胞，卵泡细胞及其核均呈长扁形，核质比较高。细胞器位于核周围的细胞质中，线粒体为圆形，数量较少，与周围的粗面内质网联系紧密。可见到高尔基体。大部分卵泡细胞与卵泡细胞及卵母细胞为平滑相贴，有时可见桥粒连接。

图1 第Ⅰ阶段卵泡细胞，可见大量深染的脂滴(→)，x 6 000Fig.1 Follicle cells in stageⅠ，plenty of hyperchromatic lipid droplet can be seen(→)，x 6 000

2.2 第Ⅱ阶段

卵母细胞开始增大。线粒体直径变小，含少量的嵴，有时与内质网及高尔基体相连系，可见哑铃型线粒体。滑面内质网增多，以单个囊池形式存在。高尔基体数量较多。胞质中脂滴数量较多，染色变浅。质膜上可见吞噬小泡。此时期卵泡细胞变为单层立方(图2)，核质比很大，细胞器数量增加，分布于核两侧。细胞质中可见成束的微丝。线粒体圆形或椭圆形，没有明显的嵴，四周围绕有丰富的内质网。细胞质中出现一些厚壁的空泡，此泡状结构膜内侧附着一薄层胶质样物质。卵泡细胞外的基膜明显，向卵泡方向形成柱状突起。

2.3 第Ⅲ阶段

卵母细胞中线粒体数量增加，呈圆形、椭圆形或哑铃型，高尔基体有时与线粒体、内质网相接。皮质颗粒增多，分为明暗两种形式，在质膜下一字排开。脂滴分布于细胞器层与核之间的胞质中。卵母细胞外围有完整的透明带。此阶段卵泡细胞增加，核大呈圆形或椭圆形，在接近核边缘出现许多微丝。线粒体多为圆形或椭圆形，有些线粒体中可见嵴。粗面内质网经常连接着线粒体。细胞质中可见厚壁的空泡(图3)。细胞膜上可见许多胞吐小泡。

图2 第Ⅱ阶段卵泡细胞，x 10 000Fig.2 Follicle cells in stageⅡ，x10 000

图3 第Ⅲ阶段卵泡细胞，可见厚壁空泡(→)，x 12 000Fig.3 Follicle cells in stageⅢ，thick walled physalides can be seen(→)，x 12 000

2.4 第Ⅳ阶段

卵母细胞非常大，核膜边缘不规则。中央区细胞器少于皮质区。线粒体呈圆形、椭圆形或哑铃型，数量增加，成群的聚集在一起(图4)。高尔基体数量较多，结构典型，主要由管状囊池构成。皮质颗粒位于卵母细胞膜下，线状排列，仍可见明、暗两种类型。脂滴数量较多，染色浅，核膜周围存在一定数量的脂滴。卵母细胞膜上仍可见吞噬小泡。透明带增厚，围绕卵母细胞(图5)。卵母细胞膜与透明带之间有缝隙，微绒毛减少，有的缩短变弯，生长方向变得没有规律，部分已经从透明带中退出。此阶段卵泡细胞的细胞核较大，胞质中可见成束的微丝(图6)。接近透明带的卵泡细胞为柱状细胞，粗面内质网丰富，可见线粒体与内质网相贴。有的卵泡细胞中存在脂滴，有的卵泡细胞中可见厚壁空泡。此外可见到卵泡细胞形成的放射状结构，卵泡细胞间空隙加大，卵丘细胞呈现出不同程度的伸展状态。卵泡细胞与卵母细胞间的桥粒连接被中断。卵泡中出现卵泡腔，卵泡液增多，与卵泡细胞连接的透明带不是平滑的，可见卵泡细胞的突起与卵细胞表面连接。

图4 第Ⅳ阶段卵泡细胞，可见成群分布的线粒体(→)，x 25 000Fig.4 Follicle cells in stageⅣ，mitochondria gathered together in groups can be seen(→)，x 25 000

图5 第Ⅳ阶段卵泡细胞，可见透明带(→)，x 5 000Fig.5 Follicle cells in stageⅣ，the pellucid zone can be seen(→)，x 5 000

图6 第Ⅳ阶段卵泡细胞，可见成束的微丝(→)，x 15 000Fig.6 Follicle cells in stageⅣ，the fascicular microfilament can be seen(→)，x 15 000

3 讨论

3.1 卵母细胞的超微结构变化

狗獾卵母细胞中的细胞器散布于细胞质中，而东北梅花鹿(Cervusnipponhortulorum)[10]、牛(Bos primigenius taurus)[11]等动物细胞器则逐渐迁移到皮质区，在细胞中央形成不含细胞器的“透明区”。

线粒体是细胞内供应能量的“动力工厂”。狗獾卵母细胞中线粒体由少增多，在第Ⅳ阶段，线粒体成群分布。线粒体逐渐增多并聚集说明线粒体为胞质内生命活动提供较高的能量水平。牛[11]、山羊(Capraaegagrushircus)[12]、东北梅花鹿[10]卵母细胞中有的线粒体具有帽状结构，在狗獾中未发现帽状结构线粒体，水貂[9]、大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)[13]、银狐(Vulpesvulpes)[14]中也未发现，这可能是物种之间的差异。

皮质颗粒是卵母细胞特有的细胞器，皮质颗粒的增殖及分布的变化被认为是卵母细胞成熟的标志之一[15]。狗獾第Ⅰ阶段卵母细胞就可见到皮质颗粒，但数量较少。这与水貂[9]、牛[11]皮质颗粒形成的时间较为相似，而有别于猪(Susscrofadomestica)[16]、大鼠、小鼠[17-18]等动物。第Ⅳ阶段时，狗獾卵巢皮质颗粒增多并呈线形排列于卵母细胞膜下，这与大多数哺乳动物是相似的，但牛存在大量的皮质颗粒成团向皮质区迁移的现象[11]。

脂滴作为营养物质的一种贮存形式，普遍存在于哺乳动物的卵母细胞中，为胚胎发育提供能量。狗獾第Ⅰ阶段卵母细胞就出现大量的脂滴，这与其他动物明显不同，水貂[19]第Ⅱ阶段开始出现脂滴，东北梅花鹿在三级卵泡的卵母细胞才偶见到少量的脂滴[10]；在脂滴数量方面：狗(Canislupusfamiliaris)[20]、马鹿(Cervuselaphus)[21]、水貂[19]的卵母细胞中脂滴数量较多，豚鼠卵母细胞内脂滴含量中等[22]，而大鼠、仓鼠和几种灵长类动物的卵母细胞内脂滴含量很少[23-24]。水貂的胚胎具有延迟着床的生理特征[25-26]，而脂滴可为延迟着床的胚胎提供营养[19]。狗獾同样具有延迟着床的特性，而且时间较水貂要长，这可能就是脂滴在狗獾中出现较早并且数量多的原因。研究中还发现，狗獾卵母细胞中的脂滴在第Ⅰ阶段时呈嗜锇性染色，且着色较深，到第Ⅳ阶段时颜色变浅。水貂也存在这样的现象，研究证明水貂脂滴的主要成分是中性脂肪和磷脂，而其颜色深表明磷脂含量高，脂滴颜色变浅与磷脂在卵泡腔形成后消失有关[19]。狗獾卵母细胞中脂滴着色深浅变化可能也是这个原因。狗獾第Ⅰ阶段直径较小而颜色深，表明其磷脂含量高，由此可推断，磷脂含量高可能是鼬科动物所具有的共同特征，这很可能与水貂和狗獾属于交配刺激排卵动物有关，第Ⅰ阶段卵母细胞储存较多磷脂，有利于为其在短时间内迅速发育成熟过程各种膜细胞器的快速增殖提供原料储备。

3.2 卵泡细胞超微结构变化

卵泡细胞为卵母细胞的生长发育提供营养物质及信息。狗獾卵泡发育过程中，可见卵泡细胞与卵母细胞通过胞质突起保持联系，这种现象同样存在于水貂[27]、东北梅花鹿[10]、牛[11]等动物中。

卵泡中细胞器随着卵母细胞的发育而更加丰富，线粒体和内质网往往相伴，核糖体散布于胞质中，这表明卵泡细胞的合成和分泌逐渐旺盛，但在狗獾的卵泡细胞中很少见到高尔基体，水貂也是如此，其原因值得探究。

狗獾卵泡细胞中存在厚壁小泡，水貂[27]及东北梅花鹿[10]也存在此结构，但其功能尚不明确。Weakley[28]认为此结构是脂滴，杨景晁[29]等人则认为是脂滴前体。

狗獾第Ⅱ阶段卵泡细胞内出现成束的微丝，并随着卵泡细胞的发育而增多。微丝在水貂、东北梅花鹿等动物中均可见，只是出现时间略有不同。目前对微丝的研究认为其功能是支持卵泡克服来自卵巢其他细胞的压力，使卵泡向外扩张。

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Melesmelesamurensis；

Ultrastructure Study on Ovarian Follicles of Meles meles amurensis

Wang Su1Ge Yanyan2Wang Guanqun1Liu Yutang1*

We used a transmission electron microscope(TEM)to study the ultrastructure of ovarian follicle development inMelesmelesamurensis.With the development of oocytes，the morphology of organelles changed，the quantity of organelles increased and the organelles were scattered in the cytoplasm.The mitochondria in stage I were initially round and then developed into a dumbbell shape and gathered together in groups in stage Ⅳ.The highly developed Golgi complex was visible in stage I.The amount of cortical granule was small in stage I but increased in number and lined up under the plasma membranes in stage Ⅳ.Lipid droplets in stage I were black，osmiophilic，of various sizes and occurred in large quantities，and they occurred in greater numbers and were less black osmiophilic in stage Ⅳ. During the development of follicle cells，their shape changed from long flat into cube or circle，numbers increased，their organelles occurred in greater numbers，and the connections between the organelles was closer.The thick walled vesicle and the fascicular microfilament were visible in the cytoplasma of follicle cells.

稿件运行过程

2016-05-06

修回日期：2016-05-20

发表日期：2016-11-10

卵巢卵泡；

超微结构；

细胞器

Ovary follicle；

Ultrastructure；

Organelles

Q952.4

A

2310-1490(2016)04-311-05

为探究狗獾卵巢卵泡的发育规律，应用透射电镜对狗獾东北亚种(Melesmelesamurensis)卵巢卵泡的超微结构进行观察，结果表明：随着卵母细胞发育，胞质内细胞器的形态发生变化，数量不断增多，并散布于细胞质中；卵母细胞质中的线粒体在第Ⅰ阶段为圆形，发育到第Ⅳ阶段可见哑铃型线粒体，并成群聚集在一起；第Ⅰ阶段卵母细胞即可见发达的高尔基复合体及少量皮质颗粒，发育到第Ⅳ阶段皮质颗粒数量增多并在质膜下一字排开；在第Ⅰ阶段卵母细胞中可见许多嗜锇性脂滴，大小不一，颜色深，第Ⅳ阶段脂滴数量较多，颜色变浅。卵泡细胞在发育过程中由长扁形变为立方形及圆形，数量增多，胞质中的细胞器逐渐增多，细胞器间的联系更加紧密；卵泡细胞质中出现厚壁的空泡；并可见成束的微丝。

国家林业局野生动植物保护司项目[林计发2015]；东北林业大学大学生创新训练项目

王素，女，21岁，本科生；主要从事野生动物与自然保护区管理研究。 E-mail：wangsu1995@163.com

*通讯作者：刘玉堂， E-mail：liu-yutang@foxmail.com