益心酮对急性酒精性肝损伤小鼠肝细胞Bcl-2、Bax表达的影响

马　申，白晶晶，刘月球，高凤玉，范　博，李素婷

（1.承德医学院2013级临床医学本科，河北承德 067000；2.承德医学院2014级临床医学本科，3.指导教师）

学生园地

益心酮对急性酒精性肝损伤小鼠肝细胞Bcl-2、Bax表达的影响

马申1，白晶晶1，刘月球1，高凤玉1，范博2，李素婷3

（1.承德医学院2013级临床医学本科，河北承德 067000；2.承德医学院2014级临床医学本科，3.指导教师）

益心酮；Bcl-2；Bax；酒精性肝损伤

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是由于长期大量饮酒导致的肝脏疾病，包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化及肝硬化。近年来研究表明，酒精作为肝细胞凋亡诱导剂，诱发肝细胞异常凋亡在ALD的发生发展中起着重要作用［1］。在众多凋亡相关基因中，Bcl-2家族与肝细胞凋亡关系密切。Bcl-2和Bax分别作为Bcl-2家族中抗凋亡和促凋亡的代表基因，在肝细胞凋亡的基因调控中起中心作用［2］。本研究建立小鼠急性酒精性肝损伤模型，观察了益心酮对凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达的影响，以探讨益心酮对酒精性肝损伤保护作用的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：昆明种小鼠，雄性，清洁级，体重22g±2g，石家庄实验动物管理中心提供。

1.1.2 主要试剂与仪器：益心酮片（山楂叶总黄酮制剂，每片含山楂叶总黄酮32mg），购于山西振东泰盛制药有限公司；56%红星二锅头白酒，北京红星酿酒厂生产；TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒，β-actin、Bcl-2、Bax兔抗小鼠多克隆抗体，辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，均购于南京凯基生物科技发展有限公司；Olympus显微镜，日本Olympus株式会社；组织切片机，德国Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 动物造模与给药［3］：雄性昆明种小鼠60只随机分为正常组、模型组、益心酮低（40mg/kg）、高（80mg/kg）剂量组，每组15只。正常组每天给予蒸馏水0.4ml灌胃，模型组和益心酮组按8ml/kg/次灌胃给予56°二锅头白酒，2次/d，连续10d天造模结束。自造模第1天起，益心酮组在每日13：00灌胃给药一次，正常组和模型组同时灌服等体积蒸馏水。实验期间各组小鼠自由饮水、进食。最后一次灌胃结束后，禁食不禁水16h，断头处死小鼠，取出肝脏。部分肝脏-80℃冻存待测，部分肝脏置于10%甲醛溶液固定。

1.2.2 检测肝细胞凋亡：肝组织10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，TUNEL法检测肝细胞凋亡情况。以肝细胞核呈棕黄色或棕褐色染色为阳性细胞，即凋亡细胞。每例标本选取5个高倍视野（400倍）观察凋亡细胞，计算凋亡细胞核数占该视野肝细胞核总数的百分比，取均值作为凋亡指数（apoptosis index，AI）。

1.2.3 Western Blotting法检测肝脏Bcl-2和Bax蛋白的表达：取新鲜肝组织100mg提取总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。取50 μ g肝组织蛋白行8% SDS-聚丙烯凝胶电泳，电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭，室温下一抗（1：200稀释）孵育2h，羊抗兔IgG/HRP二抗（1：3000稀释）室温孵育1.5h，按照ECL免疫检测试剂盒进行曝光、显影、洗片。以β-actin（1：200稀释）作为内参照，胶片扫描后获得图像。采用Quantity One 4.4分析软件测定条带灰度值，以Bcl-2、Bax蛋白条带灰度值/内参照β-actin蛋白条带灰度值作为目的蛋白的相对表达水平。

1.2.4 统计分析：采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，数据以（±s）表示，计量资料多组间比较采用方差分析，两两比较采用q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 益心酮对酒精引起小鼠肝细胞凋亡的保护作用

正常组小鼠肝细胞无或偶见凋亡，模型组小鼠肝组织中可见大量棕黄色、棕褐色凋亡细胞核，散在分布于肝小叶内。与正常组比较，模型组小鼠肝细胞AI值明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，益心酮低剂量组、高剂量组肝细胞AI值明显降低（P＜0.01，P＜0.05）。见附表。

2.2 益心酮对肝组织Bcl-2、Bax蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组小鼠肝组织Bcl-2表达明显降低、Bax表达明显升高（P＜0.01）；给予益心酮灌胃后，小鼠肝组织Bcl-2表达明显升高、Bax表达明显降低（P＜0.01，P＜0.05）。见附表：

附表 各组小鼠肝细胞AI值和肝组织Bcl-2、Bax蛋白的表达情况（±s，n=15）

附表 各组小鼠肝细胞AI值和肝组织Bcl-2、Bax蛋白的表达情况（±s，n=15）

与正常组比较：*P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.01，##P＜0.05

组别AI（%）Bcl-2Bax正常组2.92±0.881.28±0.081.08±0.11模型组11.41±1.13*0.94±0.11*3.26±0.08*益心酮低剂量组9.78±2.43##1.47±0.14##1.82±0.06##益心酮高剂量组7.96±1.84#1.68±0.07#1.26±0.12#

3 讨论

凋亡（apoptosis）是细胞在一定的生理或病理信号刺激下遵循自身程序，由基因控制的主动死亡行为。生物体通过凋亡机制完成对衰老细胞和畸形细胞的清除，但过度凋亡则会引起组织损伤，进而导致功能障碍。近年来研究表明，病毒感染、毒性物质、酒精等均可诱发肝细胞异常凋亡，引起各种急慢性肝损伤。酒精作为肝细胞凋亡诱导剂，介导的肝细胞凋亡在ALD的发生与发展中发挥重要的促进作用［4］。

肝细胞凋亡机制较为复杂，目前认为线粒体凋亡途径最为重要。Bcl-2基因家族作为线粒体凋亡途径中最有效的调控执行者，与肝细胞凋亡关系最为密切［5］。Bcl-2是凋亡抑制基因，它编码的蛋白位于线粒体外膜、内质网膜和核膜上，其抗凋亡作用的机制是抗氧化、调节线粒体的通透性、防止细胞色素C及凋亡诱导因子的释放，使凋亡效应蛋白酶链不能激活，从而阻止细胞凋亡。Bax是Bcl-2家族中目前研究最广泛的促凋亡基因，正常细胞中Bax定位于细胞质，当受到损伤或刺激后，激活的Bax结合在线粒体膜上，建立线粒体膜通道，介导细胞色素C的释放，从而诱导细胞凋亡。因此，Bcl-2与Bax表达水平的平衡结果决定了凋亡信号刺激后细胞的存活或凋亡。一切干预细胞凋亡的因素都可最终归结为对Bcl-2、Bax的改变，发挥促进或抑制细胞凋亡的作用［6］。

本研究显示，模型组小鼠肝细胞凋亡指数明显升高，表明酒精介导肝细胞凋亡是导致肝损伤的主要原因；给予益心酮干预后，肝细胞凋亡指数明显降低，表明益心酮可通过抑制肝细胞凋亡起到保肝作用。本研究同时发现，模型组小鼠肝组织Bcl-2表达明显降低、Bax表达明显增高，给予益心酮干预后，Bcl-2表达明显升高、Bax表达明显降低，表明益心酮可通过上调抑凋亡基因Bcl-2表达、下调促凋亡基因Bax表达，发挥抗凋亡作用，这可能是益心酮对酒精性肝损伤具有保护作用的重要机制之一。

［1］朱传龙，高人焘，李宜.凋亡及其调控基因Bcl-2家族在肝脏损伤中的作用［J］.实用肝脏杂志，2008，11（3）：206-209.

［2］靳雅玲，欧士钰.Bcl-2、Bax与肝纤维化关系的研究进展［J］.临床医学工程，2013，20（1）：124-126.

［3］赵敏，池莉平，王凤岩，等.小鼠急性酒精性肝损伤模型的建立及应用［J］.华南预防医学，2005，31（1）：14-17.

［4］安红姬，金武丕.乙醇诱发肝细胞凋亡的发病机制［J］.吉林医学，2007，28（10）：1155-1157.

［5］郭晨，李丹，林纳，等.表达HBVX基因的小鼠模型的建立及对肝细胞凋亡因子的影响［J］.世界华人消化杂志，2011，19（12）：1225-1230.

［6］朱玉山，卢铁元，王蕊，等.Bcl-2家族蛋白调控线粒体膜通透性和细胞色素C释放的新机制［J］.生命科学，2011，23（11）：1076-1080.

（学生园地栏目编辑：张 健）

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1004-6879（2016）02-0170-03

（2016-01-05）