HPLC法测定不同采收期承德产山里红叶牡荆素-4″-O-葡萄糖苷的含量

杜义龙，李明臣，王领弟，李艳荣，潘海峰

（河北省中药研究与开发重点实验室/承德医学院中药研究所，河北承德 067000）

HPLC法测定不同采收期承德产山里红叶牡荆素-4″-O-葡萄糖苷的含量

杜义龙，李明臣，王领弟，李艳荣，潘海峰△

（河北省中药研究与开发重点实验室/承德医学院中药研究所，河北承德 067000）

目的：采用高效液相色谱（HPLC）法测定承德地区不同采收期山里红叶中牡荆素-4″-O-葡萄糖苷的含量。方法：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18（4.6mm×250mm，5☒m）；流动相：0.1%甲酸水溶液-乙腈-四氢呋喃溶液，梯度洗脱；检测波长：340nm；流速1.0ml/min；柱温30℃。结果：牡荆素-4″-O-葡萄糖苷的线性范围是0.001-0.16mg/ml；平均加样回收率为100.2%（RSD=2.8%）；5-10月承德不同产地山里红叶中牡荆素-4″-O-葡萄糖苷的含量均值分别为滦平县3.00mg/g，双桥区4.00mg/g，承德县2.84mg/g。结论：承德地区山里红叶中牡荆素-4″-O-葡萄糖苷的含量在8月份达到最高，为最佳采收期，以承德市双桥区产的山里红叶含量最高，为最佳产地。

山里红叶；牡荆素-4″-O-葡萄糖苷；高效液相色谱法；含量测定

山里红叶为蔷薇科植物山里红Crataegus pinnatifida Bge.var.major N. E. Br.的干燥叶，主产于河北承德、山东和辽宁等地［1-3］。山里红叶药材化学成分复杂，主要为黄酮类和有机酸类［1］。现代药理实验表明，山里红叶具有降血脂、抑制血小板聚集、改善冠脉流量保护心肌和清除自由基、抗氧化等作用［4-7］。黄酮类化合物是山里红叶生理活性的主要成分，包括牡荆素-4″-O-葡萄糖苷、牡荆素等，其中牡荆素-4″-O-葡萄糖苷在山里红叶中含量较高［8］。本研究采用HPLC法测定了承德地区三个产地不同月份山里红叶中牡荆素-4″-O-葡萄糖苷的含量，以期找到牡荆素-4″-O-葡萄糖苷含量变化的规律，从而确定针对牡荆素-4″-O-葡萄糖苷的最佳采集时间，为承德山里红叶资源的开发提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Agilent1200 Series液相色谱仪（G1322A在线脱气机、G1311A二元泵、G1316A柱温箱、G1329A自动进样器、G1315D二极管阵列检测器）；Agilent Chemstation色谱工作站；KQ-700型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率700W，频率40KHz），梅特勒-托利多AG245电子分析天平，HC-2062高速离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）。

1.2 药材 山里红叶药材均由河北民族师范学院董建新教授鉴定为蔷薇科山楂属植物山里红的干燥叶，药材分别于2011年6月、7月、8月、9月、10月采自承德市滦平县、双桥区和承德县。对照品：牡荆素-4″-O-葡萄糖苷（批号，A0513），成都曼思特生物科技有限公司，纯度＞99%。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）-四氢呋喃（C），梯度洗脱方式：0-20-30-40-50min，A（90%-84%-84%-78%-74%）、B（8%-14%-14%-20%-24%）、C（2%-2%-2%-2%-2%）；色谱柱：Agilent ZORBAX SBC18（4.6mm×250mm，5☒m）；检测波长：340nm；流速1.0ml/ min；柱温30℃；进样量10☒l。山里红叶牡荆素-4″-O-葡萄糖苷色谱图见附图。

2.2 供试品溶液的制备 将山里红叶去除杂质后，65℃干燥至恒重（约2h），粉碎机粉碎后过80目筛；取山里红粉末0.5g，置于50ml具塞三角瓶中，加入80%甲醇25ml，称重；超声提取30min，称重，补足失量；过滤，续滤液过0.45☒m滤膜，即得。

附图 山里红叶HPLC色谱图

2.3 对照品溶液的制备 精密称取牡荆素-4″-O-葡萄糖苷适量，置于10ml容量瓶中，用甲醇溶解定容，制成每ml含牡荆素-4″-O-葡萄糖苷0.16mg的对照品溶液。

2.4 线性关系考察 以对照品溶液为1号溶液，采用倍比稀释法将对照品溶液制成系列浓度溶液，得2-5号对照品溶液。以2.1的色谱条件，分别取上述系列对照品溶液各10 μ l进样，记录峰面积。以峰面积（A）为纵坐标，对照品浓度（C）为横坐标，进行线性回归，回归方程为A=15875C-9.6313（r=1.0000）。牡荆素-4″-O-葡萄糖苷的线性范围是0.001-0.16mg/ml。

2.5 精密度试验 按2.2的方法制备供试液，连续进样6次，按2.1的色谱条件测定，记录峰面积，峰面积RSD＜0.5%（n=6）。表明仪器的精密度良好。

2.6 重现性试验 取同一批山里红叶药材，按2.2的方法制备6份供试品溶液，按2.1的色谱条件测定，记录峰面积，峰面积RSD＜1.5%（n=6）。表明该方法重现性较好。

2.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24h进样测定，记录峰面积，峰面积RSD＜3%（n=6）。表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验 精密称定已知牡荆素-4″-O-葡萄糖苷含量的山里红叶6份，每份0.25g，加入牡荆素-4″-O-葡萄糖苷适量，按2.2的方法制备供试品溶液，按2.1的色谱条件测定峰面积，由标准曲线方程计算样品中牡荆素-4″-O-葡萄糖苷的含量，计算平均回收率和RSD。结果见表1。

2.9 样品含量测定 取各批次山里红叶样品，按2.2的方法制备供试品溶液各3份，按2.1的色谱条件测定分析，通过回归方程计算山里红叶中牡荆素-4″-O-葡萄糖苷的含量。结果见表2：承德地区三个产地的山里红叶中，8月份牡荆素-4″-O-葡萄糖苷的含量最高，在8月份达到最高值后逐月减少；三个产地中以承德市双桥区山里红叶中牡荆素-4″-O-葡萄糖苷的含量最高。

表1 加样回收率试验结果

表2 不同采收期药材中牡荆素-4″-O-葡萄糖苷含量测定结果（mg/g）

3 讨论

研究不同采收时期药材有效成分含量的变化，对确定目标产物最佳采收期具有重要意义。本研究对承德地区6月到10月山里红叶中牡荆素-4″-O-葡萄糖苷的含量进行检测分析，结果显示8月份牡荆素-4″-O-葡萄糖苷的含量最高，为最佳采收期；三个产地中，以承德市双桥区产山里红叶中牡荆素-4″-O-葡萄糖苷的含量最高，为最佳产地。

［1］陈忠，卢树杰，张维库，等.HPLC测定山楂叶总黄酮中牡荆素鼠李糖苷含量［J］.中成药，2009，31（10）：1615-1616.

［2］郝近大.实用中药材经验鉴定［M］.北京：人民卫生出版社，2001.40-44.

［3］张文洁，杨英，张辉.山楂叶提取物对高血脂大鼠的影响［J］.辽宁中医杂志，2008，35（2）：307-308.

［4］叶希韵，张隆，张静，等.山楂叶总黄酮对乳鼠心肌细胞缺血缺氧损伤的实验研究［J］.中国现代应用药学，2005，22（3）：202-204.

［5］蔡久英.山楂叶汤和银杏叶片对冠状动脉粥样硬化性心脏病患者血脂载脂蛋白和血小板聚集功能影响的比较［J］.中国中西医结合急救杂志，1999，6（8）：344-346.

［6］于秋红，黄沛力，张淑华，等.山楂叶提取物抗氧化作用［J］.中国公共卫生，2006，22（4）：463-464.

［7］王领弟，李艳荣，张晓峰，等.山楂叶指纹图谱研究［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17（19）：74-78.（收稿日期：2015-10-12）

CONTENT DETERMINATION OF VITEXIN -4”-O-GLUCOSIDE IN CHENGDE HAWTHORN LEAF AT DIFFERENT COLLECTING TIME BY HPLC

DU Yi-long， LI Ming-chen， WANG Ling-di， et al
（Hebei Key Laboratory of Research and Exploitation of Traditional Chinese Medicine， Institute of Chinese Materia Medica，Chengde Medical College， Hebei Chengde 067000， China）

Objective: To determine the content of vitexin -4”-O-glucoside in Chengde hawthorn leaf at different collecting time by HPLC. Methods: The separation was carried out in Agilent ZORBAX SB-C18column （4.6mm×250mm，5μm） with 0.1% formic acid， acetonitrile and tetrahydrofuran as mobile phase in gradient elution model （detection wave: 340nm， fl ow rate:1.0ml/min， column temperature:30℃）. Results: The linear range of vitexin -4”-O-glucoside was 0.001-0.16 mg/ml. The average recovery rate was 100.2% （RSD=2.8%）. The average content of vitexin -4”-O-glucoside in Chengde hawthorn leaf from May to October was respectively 3.00mg/g from Luanping County， 4.00mg/g from Shuangqiao District and 2.84mg/g from Chengde County. Conclusions: According to the content of vitexin -4”-O-glucoside， August is the optimum collecting time and Shuangqiao District is the optimal producing area.

Hawthorn leaf； Vitexin -4”-O-glucoside； HPLC； Content determination

△

R284.1

A

1004-6879（2016）02-099-03