高效液相测定鸡肉中糖皮质激素的方法

李晓丹+张学青+冯静+王娜+闫师杰

摘 要：优化了鸡肉中糖皮质激素残留的液相色谱分析方法。采用甲醇、二氧六环、乙腈∶水∶甲酸（30∶70∶0.1）、乙酸乙酯做提取剂，提取样品中的地塞米松与泼尼松龙，使用了10%乙腈/水和乙腈饱和的正己烷作为净化剂，采用超声分离法提取激素，通过液相色谱进行分析。本试验研究了流动相条件、体积流量、提取溶剂、净化溶剂等条件对地塞米松和泼尼松龙这两种目标物检测状况的影响，确定最佳流动相比例为30∶70，最佳体积流量为1 mL·min-1，最佳提取剂为乙腈∶水∶甲酸（30∶70∶0.1）混合液，其加标回收率达到98.3%。在鸡肉样品中，泼尼松龙的线性范围为0.1～10 μg·L -1，RSD为0.1%，检出限约为10 ng；地塞米松的线性范围为0.5～10 μg·L -1，RSD为0.2%，检出限约为10 ng，相对标准偏差均为0.99左右。

关键词：液相色谱法；鸡肉；地塞米松；泼尼松龙

中图分类号：Q95-3 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.09.013

Abstract ：The analysis method of chicken glucocorticoid residues by liquid chromatography was established in this paper. Methanol， dioxane， acetonitrile∶ water∶ formic acid （30∶70∶0.1） and ethyl acetate were used to extract the dexamethasone and prednisolone in samples. 10% acetonitrile/water and acetonitrile saturated n-hexane were used as purifying agent. Hormone has been extracted by ultrasonic separation method. The test solution has been analyzed by liquid chromatograph， using C18 chromatographic column separation and external standard method to quantify. This experiment focused on the effect of targets detection status of dexamethasone and prednisolone in terms of the mobile phase conditions， the volumetric flow， the extraction solvent， the purification solvents and other factors. So it was confirmed that the optimum mobile phase ratio was 30∶70， the optimal volumetric flow was 1 mL·min-1 and the best extraction agent is mixed liquor， acetonitrile∶ water∶ formic acid （30∶70∶0.1）， where the recovery rate has reached 98.3%. In the chicken samples， the linear range of prednisolone was 0.1～10 μg·L-1 and the RSD was 0.1% where the detection limit was about 10 ng； the linear range of dexamethasone was 0.5～10 μg·L-1and the RSD was 0.2% where the detection limit was about 10 ng， the relative standard deviation was about 0.99.

Key words： liquid chromatography； dexamethasone ； prednisolone； chicken

现代社会中畜牧业可以为人类提供极其丰富的肉、禽、奶、蛋等畜产品，但随着畜牧业的发展和社会经济的增长，畜产品中的药物残留污染已经成为一大社会问题，对人类身体健康的公共卫生造成了较大的危害[1]。有研究表明，人类常见的癌症、畸形、抗药性、青少年早熟、中老年心血管疾病等问题均与畜禽产品中的抗生素、激素等药物的残留有关[2]。其中，糖皮质激素在医学上可用于治疗过敏、哮喘等疾病，合成糖皮质激素如倍他米松、地塞米松等，具有很强的抗炎作用，在兽医中被广泛用于治疗呼吸道、胃肠疾病等[3]。然而，很多不法分子在经济利益的驱使下超量使用这些药物以便缩短育肥期、降低饲料成本，或者给畜禽注射激素药物，让其增肥增重从而达到促进动物的生长和提高瘦肉率的效果[4]。因此，各国对动物源性食品中糖皮质激素残留量的检测都十分重视。目前，测定食品中糖皮质激素残留的方法主要有气相色谱法（GC）[5]、高效液相色谱法 （HPLC）、气相色谱-质谱法（GC-MS）和液相色谱-质谱法（LC-MS）等[2]。本试验利用高效液相色谱法对样品前处理过程中鸡肉中糖皮质激素提取剂进行了筛选，并优化了高效液相色谱仪检测条件，从而确定一种效率较高、准确度较好的方法对糖皮质激素进行检测。

1 材料和方法

1.1 材 料

鸡肉购于天津市西青区红旗农贸市场，地塞米松标准品（Dexamethasone）和泼尼松龙标准品（Prednisolone）购于北京中科质检生物技术有限公司。endprint

1.2 方 法

1.2.1 鸡肉中糖皮质激素提取剂的选取 本试验分别选用了甲醇[4]、二氧六环[6]、乙腈∶水∶甲酸（30∶70∶0.1）[7]和乙酸乙酯4种提取剂。分别称取地塞米松和泼尼松龙两种糖皮质激素标准品，用甲醇溶解并稀释至每1 mL各含10 μg的溶液，制为混合标液。

称量（2±0.05） g 样品，加入分别含有10 μg·mL-1的地塞米松和泼尼松龙混合标液，放置1 h使其充分渗透到鸡肉中后进行研磨[8]，并分别加入甲醇/二氧六环/乙腈∶水∶甲酸（30∶70∶0.1）50 mL或乙酸乙酯20 mL，并转移到锥形瓶中，放入超声震荡仪中震荡20 min，随后进行过滤，于40 ℃水浴锅中水浴至干[9]。取出后，加5 mL提取剂溶解残渣，转移至离心管，加入2 mL10%乙腈/水和2 mL经乙腈饱和的正己烷，漩涡混合，静置，待分层后取下层溶液15 000 r·min-1离心5 min[10]，0.45 μm微孔滤膜过滤，用高效液相色谱法进行检测，计算其加标回收率，加标回收率最高的提取剂为试验选用的最优提取剂。

1.2.2 液相色谱检测条件的确定 （1）流动相比例的确定。本试验所用液相色谱为Agilent 6300，色谱条件采用Thermo BDS Hypersil C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）； 0.1%甲酸的水溶液作为流动相A，以乙腈作为流动相B，柱温箱温度35.0 ℃[11]，检测器波长范围200 ～ 240 nm[9]，带宽4 nm，进样量20.0 μL，分别对流动相比例A∶B为80∶20、A∶B为70∶30以及A∶B为60∶40进行研究和探讨，此时体积流量设定为1 mL·min-1。

（2）体积流量的确定。本试验探究了当体积流量分别为0.8 mL·min-1或1 mL·min-1时对试验的影响，从而调整液相色谱条件，使试验结果更佳。

（3）标准曲线的测定。分别精密称取适量地塞米松和泼尼松龙两种糖皮质激素标准品，加甲醇制成每1 mL各含0，2，4，6，8，10 μg的混合标液[11]，取混合标液20 μL注入高效液相色谱仪进行分析。

2 结果与分析

2.1 色谱条件分析

2.1.1 洗脱条件的确定 为探究本试验中液相色谱的最佳运行条件，试验时使用地塞米松与泼尼松龙的混合标液对洗脱条件进行分析，每次进样量为20 μL，试验结果见图1～图3。

当洗脱条件为80%A+20%B时，液相色谱图没有明显的激素峰出现，且基线偏离严重，此浓度无法洗脱出地塞米松和泼尼松龙；当洗脱条件变换为70%A+30%B时，出峰清晰且分离时间适宜；当洗脱条件设置为60%A+40%B时，色谱图中的峰无法分离，看不出有明显的峰出现，无法确认计算。因而，只有当B和A的比例为3∶7时，出峰清晰且分离时间适宜，选为最适合的洗脱条件（图4）。

2.1.2 体积流量的确定 体积流量设定为0.8 mL·min-1时，基线偏离较大，且混标分离效果较差；体积流量设定为1 mL·min-1时，虽有少数微小的杂峰波动，但要测定的激素峰分离效果好，基线较平，出峰时间合适，因此，选定1 mL·min-1为最适体积流量。

2.1.3 标准曲线的测定 以地塞米松与泼尼松龙混合标准品溶液进样量（μg·min-1）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，见表1。由表1可得出标准曲线的回归方程、相关系数、线性范围以及定量限。地塞米松与泼尼松龙的相关系数均大于0.99，表明是高度相关，定量限较小说明此检测方法具有较灵敏的定量检测能力，检测结果准确可靠。

2.1.4 精密度试验 取10 μg·min-1的地塞米松与泼尼松龙混合标液，连续进样6次，每次进样20 μL，测定各峰面积，得出检出量，见表2。根据公式计算得地塞米松、泼尼松龙的RSD分别为0.1%，0.2%，均小于1.0%，表示此试验精密度较高，满足试验需求。

2.1.5 检出限确定 取地塞米松、泼尼松龙对照品贮备溶液，用流动相多次稀释后，注入液相色谱仪进行测定，测定结果见表3。通过公式计算得到这两种糖皮质激素的检出限约为10 ng，即相当于添加量为每克剂量0.005 mg。

2.2 鸡肉中糖皮质激素最佳提取剂的确定

根据2.1.1和2.1.2中所确立的分离效果较好的洗脱条件和体积流量设置液相色谱条件，检测 1.2.1中使用不同提取剂分别对鸡肉中的地塞米松和泼尼松龙进行提取后的提取液，通过计算得出加标回收率，结果见表4。

根据对加标回收率的比较可以看出，使用乙腈∶水∶甲酸（30∶70∶0.1）做提取剂对地塞米松和泼尼松龙两种糖皮质激素的提取效率是最高的，在液相色谱条件确定的情况下加标回收率最高，表明损失量最少。

3 结论与讨论

本试验通过HPLC对鸡肉中糖皮质激素提取剂进行了筛选，发现甲醇在做提取剂时，由于甲醇极性较强，提取杂质较多，在净化分层后虽然能有效分离油脂蛋白质，但上层较容易出现挂壁等问题，使得在吸取下层时仍有可能混入少量蛋白质等杂质，因而，在高效液相色谱中易出现杂峰影响判断。同时二氧六环做提取剂时，有一定的刺激性，操作较为繁琐，提取、过滤、水浴蒸干等过程尽量要在通风橱中进行，且其在水浴蒸干过程中耗时较久，较难蒸干。而使用乙酸乙酯做提取剂，鸡肉不容易散开而会凝结成团状，会导致提取效率不够高，且乙酸乙酯有较强的刺激性气味，需要在通风橱中进行操作，增加了试验的繁琐性。使用乙腈∶水∶甲酸（30∶70∶0.1）混合液做提取剂时，甲酸有较强腐蚀性和刺激性，要注意穿戴防护服和防护手套，在过程中，由于甲酸的加入会分解肉品中的纤维，使鸡肉成粉末状，使得过滤过程较为艰难，非常容易堵塞滤纸孔，但优点在于对糖皮质激素的提取效率会更高，因而检测性比较好。

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