白芨的离体培养

张豆豆, 彭晓英， 朱永州， 杨亚博， 敖东阳

(1.湖南农业大学 生物科学技术学院， 湖南 长沙 410128； 2.慈利县龙潭河镇农业技术推广站， 湖南 慈利 427228)

白芨的离体培养

张豆豆1, 彭晓英1， 朱永州2， 杨亚博1， 敖东阳1

(1.湖南农业大学 生物科学技术学院， 湖南 长沙 410128； 2.慈利县龙潭河镇农业技术推广站， 湖南 慈利 427228)

为快速生产大量优质白芨种苗，以白芨种子为外植体进行离体快繁研究。结果表明： MS基本培养基可促进白芨种子的快速无菌萌发，当6-BA的浓度为1.0 mg/L时可以促进幼苗的快速分裂生长，添加了2 mg/L的2,4-D的培养基可有效促进愈伤组织的形成。种子苗原球茎经切割后在MS+2 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA的培养基上愈伤组织诱导率为85%，1.0 mg/L的6-BA和0.15 mg/L的NAA配比可以诱导丛生芽的生长和增殖， 添加了70 g/L香蕉泥和0.5 mg/L NAA的1/2MS培养基可有效促进根的生长。无菌发芽的种子苗移栽率可以达90%, 而试管苗移栽的成活率较低，但随离体培养时间的延长有所提高。

白芨； 愈伤组织； 快速繁殖； 增殖系数

白芨 (Bletillastriata)又名甘根、紫兰[1]等，为兰科( Orchidaceae)白芨属多年生草本植物[2]。白芨花色鲜艳，具有极高的观赏价值[3]；其地下假鳞茎作为一味价值极高的中药材，具有补肺、止血、消肿、生肌、敛疮的作用[4]。近年来，野生白芨的数量在随着不断地过度采挖而急剧减少[5]，已被国家列为重点保护的野生药用植物之一[6]。随着我国中药事业的发展，白芨在临床上的应用不断扩大，用药需求也急剧增加[7]，且白芨中含量较高的白芨胶可作为乳化剂广泛应用于食品、美容及化工领域[8]。白芨虽有数以万计的种子，却大都无胚乳，在自然界很难萌发和生长[9]，且其分株繁殖周期长，繁殖率低[10]，远远不能满足商品化生产的需求。因此，保护野生白芨，解决白芨的资源问题已成为当务之急。为了解决白芨的资源供求问题，缩短其育种周期，满足对市场的需求，前人利用组织培养技术，分别从外植体的选取、消毒的方法以及生长调节剂和营养物质的添加方面对白芨的快速繁殖进行了探讨。为快速地大量繁殖种苗，本试验拟以白芨种子为外植体来进行离体培养，建立一套较为完整的白芨快繁体系，摆脱季节和时间的限制，短时期内获得大量适于野外生长的白芨幼苗，为实现白芨的快速繁殖和工业化生产提供一定的实验基础和技术支持。

1 材料与方法

1.1试验材料

供试材料为成熟未开裂的野生白芨蒴果，采自慈利县金坪镇。

1.2试验方法

1.2.1 白芨蒴果的消毒及种子接种 用75%的酒精棉球擦拭蒴果表面，用解剖刀剖开果实中部，用镊子夹取种子接种至分别添加了不同2，4-D和6-BA配比的培养基中(见表1)，培养基pH值为5.8，蔗糖含量为3%，琼脂为0.6%，置于组培室中光照2000 lx，16 h/d,温度25 ℃条件下培养，记录种子和愈伤组织启动的情况。

1.2.2 愈伤组织的诱导和增殖 将部分长成的原球茎及幼苗的叶片经切割之后分别接种到不同2，4-D和6-BA配比的培养基中(见表2)，观察记录愈伤组织的诱导和增殖情况。

1.2.3 丛生芽的分化及增殖 将愈伤组织接到以MS为基本培养基，添加不同浓度6-BA和NAA激素配比的培养基中(见表3)，置于组培室中培养，记录丛生芽的诱导与增殖情况，分析数据得出增殖系数。

1.2.4 壮苗生根培养 将株高约3 cm,长势较好的幼苗转接到生根培养基中进行壮苗生根培养,壮苗生根培养以添加0.5～1.0 mg/L的NAA为主，另添加70 g/L的香蕉泥或1%的番茄汁来增强效果。培养基设为六种(见表4)，每种培养基接种5瓶，置于组培室中培养，记录幼苗的生根状况。

1.2.5 炼苗与移栽 将株高4 cm，生有3 cm长根的白芨试管苗和无菌萌发的种子苗分别在自然光下进行炼苗培养，打开培养基瓶盖,洗净培养基后于自然光下水培养3天以上，待其适应自然环境再将其移栽入盆中培养。

2 结果与分析

2.1不同培养基对白芨种子诱导的影响

接种到培养基上的种子在20天左右开始萌动，由原来的黄褐色逐渐变为绿色；30天后部分种子长出带浅绿色芽点的小球状体，即原球茎；40天后可观察到接种到①号、②号和④号培养基上的芽点突出长成翠绿色的小尖芽(见图1)；接种到③号和⑤号培养基上的原球茎在其表面产生了浅黄绿色的较疏松的愈伤组织。通过观察对比发现，不同的培养基对种子萌动的影响各有差别。其中萌发率最高的是①号MS 0培养基，萌发率高达95%(见图1a)，②号和④号培养基中的萌发情况次之，分别为80%和85%，③号和⑤号的种子启动时伴有愈伤组织的形成，但萌发率最低(见表1)。由表1可知，①号MS 0培养基具备了白芨种子萌发所需的主要营养物质，比添加了生长调节剂2,4-D和6-BA的培养基更能促进白芨种子的正常萌发；6-BA含量较高的培养基(②号、④号)比2,4-D含量较高的培养基中种子的萌发率增加，说明6-BA可促进白芨种子的萌发和芽的分化，而2,4-D的添加则可促进白芨幼苗启动过程中愈伤组织的形成。

表1 不同培养阶段种子的萌动Tab.1 Seedinitiationrateofdifferenttrainingstages培养基编号(MS)6—BA(mg/L)2,4—D(mg/L)萌动率(%)20天30天40天①0010.05095②2.00.50.23080③0.52.00.12570④1.001.03585⑤01.00.12060

2.2不同生长调节剂浓度配比对愈伤组织诱导和增殖的影响

经切割后转接在添加6-BA和2,4-D不同浓度配比的培养基上的种子苗原球茎在15天后开始在周边长出浅绿色的疏松的小块愈伤组织，30天后愈伤组织增多，生长致密，且有部分愈伤组织开始分化出翠绿色的小芽尖。而叶片的愈伤组织诱导率极低，未见明显的愈伤组织形成，说明白芨叶片不适于诱导愈伤组织，这可能与白芨叶片中缺乏具分裂能力的形成层细胞有关。对以原球茎作为外植体的愈伤组织诱导的结果如表2。

从表2中可知，原球茎愈伤组织的诱导率随2,4-D浓度的增大而增加，⑤号培养基2,4-D浓度为2 mg/L时，愈伤组织诱导率最高，可达到85%，0.5 mg/L的6-BA的添加更有助于愈伤组织的诱导且愈伤组织颜色偏绿且出现浅绿色芽点，质地致密，更有利于后期分化；但随着6-BA浓度的增大，愈伤组织诱导率有所下降，且出现少许褐化现象，表现出过多6-BA对愈伤组织诱导的抑制作用。

2.3不同生长调节剂浓度配比对白芨幼苗丛生芽分化和增殖的影响

将具有芽点的愈伤组织接种到丛生芽分化和增殖的培养基中，30天后观察到嫩芽尖伸长且丛生芽数量增加，50天增殖系数最高。由表3可知，添加不同浓度配比NAA和6-BA的培养基对丛生芽的增殖有不同的影响作用，随6-BA浓度的增大，芽的增殖系数增加，6-BA浓度为1.0 mg/L时，芽的增殖系数最高可达到3.72，但当浓度升高为1.5 mg/L时，芽的增殖系数却降低。培养基中添加0.15 mg/L NAA比0.2 mg/L NAA更能促进芽的增殖和生长。故培养基为②MS+6-BA1.0 mg/L+NAA 0.15 mg/L时增殖效果最好，且幼苗生长的颜色翠绿鲜艳，长势较好(见图1b、c、d)。

表3 不同生长调节剂对丛生芽增殖的影响Tab.3 Influenceofdifferentgrowthregulatortoclumpbudgeneration培养基编号(MS)6—BA(mg/L)NAA(mg/L)接种芽数(个)增殖芽数(个)增殖系数①0.50.1550901.8②1.00.15501863.72③1.50.15501603.2④0.50.2501002.0⑤1.00.2501082.16⑥1.50.2501452.9

2.4不同培养基对白芨壮苗生根的影响

将株高约3 cm的白芨苗接种到壮苗生根的培养基中，30天后茎基部有白色突起，随后向培养基内延伸，长成白色的幼根。不同培养基对白芨壮苗生根状况的影响如表4所示：基本培养基为1/2MS时，生根状况较MS好；当NAA浓度为0.5 mg/L时为最适促生根浓度，植株长势较好，叶片翠绿(见图1e)；而当培养基为②1/2MS+NAA 0.5 mg/L+香蕉泥70 g/L时，由于香蕉泥的存在，叶片长势较其他均大，且植株较高(见图1f,g)，可以得出香蕉泥对白芨幼苗的壮苗生根具明显促进作用；番茄汁对白芨壮苗有一定的影响，但作用不如香蕉泥明显；IAA对白芨幼苗壮苗生根并无较大影响。

表4 不同培养基对白芨壮苗生根的影响Tab.4 Influenceofdifferentculturemediumonbletillaseed-lingroot培养基编号基本培养基NAA(mg/L)IAA(mg/L)香蕉泥(g/L)番茄汁(%)生根率(%)①1/2MS0.592②1/2MS0.57093③MS1.01.065④MS1.00.570⑤MS1.00.5170⑥MS1.00.57075

2.5不同幼苗经移栽后的生长情况

不同的试管苗和无菌种子幼苗经移栽后，成活率有很大差异，如表5所示，相同条件下移栽种子苗的成活率可达90%，较试管苗的高，且生长较好。而培养瓶内生长不同时间的试管苗经移栽后成活率随培养时间的延长而增大，生根后继续培养45天之后的试管苗经移栽后成活率可达33.3%。

表5 移栽苗的生长状况Tab.5 Thegrowthconditionsoftransplantseedling移栽苗的类型移栽苗数成活苗数成活率(%)无菌种子苗50459015天后试管苗300030天后试管苗30413.345天后试管苗301033.3

图1 白芨的离体培养(a.白芨种子的诱导 b.c.d.丛生芽的诱导与增殖 e.f.g.白芨幼苗的壮苗及生根)Fig. 1 In vitro culture of Bletilla

3 结论与讨论

白芨成熟蒴果中的种子极其微小但数量极多，利用白芨种子萌发进行快速繁殖，在较短时间内可以获得大量比较合格的种子幼苗，移栽成活率可达90%。为实现快速增殖，该研究还尝试通过器官发生型途径即在白芨种子苗萌动过程中诱导愈伤组织并分化丛芽来进行培养。

3.1不同浓度配比的植物生长调节剂对白芨种子离体诱导的影响

经试验可知，MS 0培养基对种子的正常萌发起促进作用，添加不同浓度配比6-BA和2,4-D的MS培养基对白芨种子的无菌萌发和启动具有明显的不同效果，其中1 mg/L 6-BA的适量添加能促进种子的萌发和芽的分化，且原球茎的分化时间较快并易成型，这与袁宁等[11]研究的结果相似；添加2 mg/L 2,4-D的MS培养基能促进幼苗萌动过程中愈伤组织的形成，从而改变种子苗萌发的途径，转为器官发生型途径，愈伤组织的诱导及增殖最适培养基为MS+2 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA，这与石云平等[12]对诱导白芨愈伤组织的研究时发现的问题一样，在该过程中容易发生褐化现象，今后还需要进一步探讨其原因并在培养基中加入适量活性炭或抗坏血酸[13]以减轻褐化的抑制作用。

6-BA和NAA的协同作用极大地促进了愈伤组织的分化和芽的增殖，江胜徳等[14]还认为NAA的影响要大于6-BA,本试验中最适培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.15 mg/L时，增殖系数高达3.72，这也与前人的结论相一致并与叶静等[15]的报道相似，说明此类激素配比对白芨丛生芽诱导增殖有良好的效果。

3.2不同复合性营养物质对白芨诱导的影响

已有多项研究表明，培养基中不同复合性营养物质(如马铃薯汁、番茄汁、椰子汁、蜂王浆等)的添加可促进对离体培养中植物组织的生长发育[16-18]。有研究认为，番茄汁对白芨无根苗的生根和壮苗有明显的促进作用，而本试验中白芨的壮苗生根培养基以1/2MS+NAA 0.5 mg/L+香蕉泥70 g/L的效果最为显著，香蕉泥的添加虽然对生根率的影响不大,但生根试管苗的植株较高且叶片长势好,具光泽，说明香蕉泥对白芨的生根和壮苗状况有较好的促进作用。

3.3不同培养时间对白芨试管苗生根移栽的影响

已有报道表明经移栽后的白芨无菌种子苗成活率较高[19]，本研究中结果也是一样，但生根的试管苗移栽的成活率却极低，且出现随瓶内生根培养时间的延长而成活率逐渐升高的现象。经观察发现，白芨无菌种子苗在生长的过程中会在茎基部膨大形成球形的原球茎，继而在原球茎上长出不定根吸收基质的水分和无机盐，输送到植株地上部分，能通过自养成活。而离体培养不定芽生根不久形成的试管苗一旦离开培养基栽培到基质中就会根部腐烂致死，但如果在培养基中继续培养至45天之后，部分试管苗的基部也会形成类原球茎，萌发出根，从而能够移栽成活。这和曾经报道的盾叶薯蓣[20]试管苗移栽的研究相似，故今后可以着眼于诱导白芨试管苗类原球茎的发生及提高试管苗成活率的研究，从而可以脱离种子苗培养的限制，实现真正意义上的离体培养快速繁殖。

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CultureinvitroofBletillastriata

ZHANG Doudou1, PENG Xiaoying1, ZHU Yongzhou2, YANG Yabo1, AO Dongyang1

(1.Bioscience and Technology College , Hunan Agricultural University,Changsha 410128, China; 2.Longtanhe Agro-technical Station in Cili, Cili 427228, China)

To propagate the high quality seedlings ofBletillastriatarapidly, the seeds were used as explants for in vitro culture.The results showed that, MS basic medium could promote the rapid aseptic germination of bletilla seeds.When the concentration of 6-BA was 1.0 mg/L could promote the rapid growth of seedlings.The medium added with 2 mg/L 2, 4-D could effectively promote the formation of callus.The callus induction rate on the medium of MS+2 mg/L 2, 4-D+0.5 mg/L 6-BA was 85%. 1.0 mg/L 6-BA and 0.15 mg/L NAA could induce the rapid proliferation of clump buds.And the medium of 1/2MS added with 0.5 mg/L NAA and 70 g/L banana puree could effectively promote the root development.The transplant survival rate of aseptic seedling was 90%，whereas the survival rate of the plantlets was lower.

Bletillastriata; callus; rapid propagation; proliferation coefficient

2016-07-15

长沙市科技局一般项目(K1406021-21)；2014年度湖南农业大学生科院大学生创新性研究项目。

张豆豆(1993-)，女，河南省漯河市人，本科，研究方向：生物技术专业。

彭晓英，女，博士，副教授；E-mail:xypeng@hunau.net。

S 682.31; S 567.9

A

1003-5710(2016)05-0047-05

10. 3969/j. issn. 1003-5710. 2016. 05. 009

(文字编校：龚玉子)