低温胁迫对8份冰草属植物幼苗生理特性的影响及抗寒性评价

闫伟红，马玉宝，张晶然，王 凯，孟庆伟

（1.中国农业科学院草原研究所/农业部牧草资源与利用重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010010；2.呼和浩特职业学院，内蒙古呼和浩特 010010；3.内蒙古商贸职业学院，内蒙古呼和浩特 010010）

低温胁迫对8份冰草属植物幼苗生理特性的影响及抗寒性评价

闫伟红1，马玉宝1，张晶然2，王 凯1，孟庆伟3

（1.中国农业科学院草原研究所/农业部牧草资源与利用重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010010；2.呼和浩特职业学院，内蒙古呼和浩特 010010；3.内蒙古商贸职业学院，内蒙古呼和浩特 010010）

采用室内低温培养箱模拟低温胁迫，对8份来自不同产地的冰草属植物材料进行胁迫，并测定8份材料幼苗的电导率、丙二醛（MDA）含量、过氧化物酶（POD）活性、游离脯氨酸（Pro）含量和可溶性蛋白质含量等5项生理指标的变化。结果表明：随着低温胁迫程度加强，8份材料幼苗游离脯氨酸含量、可溶性蛋白质含量与过氧化物酶活性均能提高其抗寒性，其中游离脯氨酸含量的贡献最大；运用隶属函数法进行综合评价8份冰草属植物幼苗的抗寒性顺序为：细茎冰草＞蒙古冰草（宁夏）＞蒙古冰草（内清）＞蒙古冰草（内农）＞冰草＞光穗冰草＞沙生冰草＞蒙古冰草（甘肃）。

冰草属；低温胁迫；生理指标；抗寒性

冰草属植物，是温带干旱地区最重要的牧草之一〔1〕，根为须状、密生、具砂套和入土较深特性，又是一种良好的水土保持植物和固沙植物，生于干燥草地、山坡、丘陵以及沙地。由于品质好，营养丰富，适口性好，各种家畜均喜食；返青早，能较早地为放牧家畜提供青饲料，是一种比较重要的牧草。由于返青早，所以容易受到低温伤害的影响。只有对植物的低温伤害机理有了全面而又深刻的认识，才能更好地解决低温伤害问题。所以研究其抗寒性，对冰草的正常生长发育、营养物质的积累以及培育优良牧草有重要意义。

植物在长期的进化过程中，由于适应环境逐渐形成了一套完整的对外界刺激的反应机制，包括对外界刺激的感受、信号的放大、传输及做出应答，从而引起相应的生理指标变化，生理指标的变化是植物自我保护的重要机制之一〔2-5〕。很多植物在低温下，经过长期的自然选择和自身的遗传变异，形成了有效的对付低温和逆境胁迫的生理适应机制。

本研究以八种冰草属植物幼苗为试验材料，利用室内低温模拟进行的低温胁迫处理，测定不同温度胁迫下植物电解质外渗率、游离脯氨酸含量、丙二醛含量、POD、可溶性蛋白等指标，分析低温下各生理指标的变化规律，并对不同材料进行综合性抗寒性评价，为冰草属植物抗寒性机理研究提供基础数据，同时为今后冰草的生产栽培、资源利用和植物抗寒性鉴定提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试冰草属植物种质材料由中国农业科学院草原研究所提供，见表1。

表1 供试冰草属植物材料Table1 The basic complexion of test materials

1.2 试验设计

供试材料选取均匀一致的种子种到直径18cm左右的花盆中。控制条件（光照14h/26℃，黑暗10h/18℃，相对湿度均为50%），温室正常生长，生长期间按常规进行统一管理，幼苗材料长至8～10 cm时开始处理。采用室内人工模拟低温试验〔6〕，设置5个温度梯度（25℃、15℃、5℃、0℃、-5℃）因素，各处理均设3个重复，将低温培养箱温度分别调在25℃、15℃、5℃、0℃、-5℃条件下处理3天。之后，进行细胞膜透性、过氧化物酶的活性（POD）、游离脯氨酸含量、丙二醛含量、可溶性蛋白含量等各项理化指标测定。

1.3 生理指标的测定及方法

细胞伤害率采用电导法测定；脯氨酸（Pro）含量采用茚三酮显色法测定；丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法色测定；POD活性采用愈创木酚氧化比色法测定；可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250染色法测定〔6〕。

1.4 数据处理

所有数据的统计学分析应用SAS软件进行方差和相关分析，应用Microsoft Excel 2003对试验数据进行作图。

应用Fuzzy数学中隶属函数法〔7〕进行综合分析评价抗寒性，其计算公式如下：

与抗寒性呈正相关的参数POD、可溶性蛋白质和脯氨酸采用公式：

与抗寒性呈负相关的参数电导率、MDA采用公式：

式中，U（Xijk）为第i个品系第j个取样阶段第k项指标的隶属度，且U（Xijk）∈〔0，1〕；Xijk表示第i个品系第j个取样阶段第k个指标测定值；Xmax、Xmin为所有参试品系中第k项指标的最大值和最小值。运用上述公式（1）、（2）求出不同的温度处理下各品系各指标参数的隶属函数值，再将其累加起来求其平均值得此指标的综合评价值。综合评价值越大，抗寒性越强。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫对8份冰草属植物幼苗细胞膜透性的影响

相对电导率常被等同于电解质渗出率，用来直接说明细胞膜受伤害情况。抗寒力越低的植物受冻后细胞透性变化越大，电解质外渗程度越强，电导率就越高，质膜的受损程度逐渐加大，其通透性增加，细胞失水。由图1和表2显示，8份冰草属植物幼苗相对电导率变化趋势基本一致，表现随着胁迫温度的降低相对电导率逐渐增加，但是不同材料在不同胁迫温度下增加幅度各有不同。其中在25～15℃段，除蒙古冰草（内清）、蒙古冰草（甘肃）相对电导率差异不显著外，其它材料相对电导率差异均显著；在15～5℃段，各材料相对电导率差异均显著；在5～0℃段，除光穗冰草、冰草和蒙古冰草（内农）相对电导率差异不显著外，其它材料相对电导率差异均显著；在0～-5℃段，除沙生冰草、蒙古冰草（内清）的相对电导率差异不显著外，其它材料相对电导率差异均显著。可以看出，在低温胁迫后期蒙古冰草（甘肃）、蒙古冰草（宁夏）和冰草相对电导率增加幅度较其它材料明显加大，其它材料相对电导率表现为平稳上升。

图1 8份冰草属植物幼苗在低温胁迫下相对电导率的变化Fig 1 The change of relative electric conductivity of 8 Agropyron Gaertn seedling under low temperature stress

表2 8份冰草属植物幼苗在低温胁迫下电导率的变化Table2 The change of electric conductivity of 8 Agropyron Gaertn seedling under low temperature stress

2.2 低温胁迫对8份冰草属植物幼苗脯氨酸的影响

脯氨酸（proline）是一种无毒的中性物质，溶解度高，能够维持细胞的膨压，具有极性，对生物多聚体的空间结构有保护作用，能增加结构的稳定性。由图2和表3可知，随着胁迫温度的降低，沙生冰草、蒙古冰草（内清）、细茎冰草、光穗冰草、蒙古冰草（内农）脯氨酸含量逐渐增加，蒙古冰草（甘肃）、蒙古冰草（宁夏）、冰草脯氨酸含量表现为先升高后下降的趋势，分别在0℃时达到最高峰。其中在25～15℃段，除了沙生冰草、蒙古冰草（内农）脯氨酸含量变化不显著外，其他材料变化差异均显著；在15～5℃段，除了蒙古冰草（宁夏）、冰草脯氨酸含量变化不显著外，其他材料差异均显著；5～0℃各材料脯氨酸含量变化均显著；0～-5℃除了蒙古冰草（内农），其他材料脯氨酸含量差异均显著。

图2 8份冰草属植物幼苗在低温胁迫下脯氨酸含量的变化Figure 2 The change of proline of 8 Agropyron Gaertn seedling under low temperature stress

表3 8份冰草属植物幼苗在低温胁迫下脯氨酸含量的变化（mg/g）Table3 The change of proline of 8 Agropyron Gaertn seedling under low temperature stress（mg/g）

2.3 低温胁迫对8份冰草属植物幼苗丙二醛含量的影响

丙二醛（MDA）是细胞膜脂过氧化的产物，其含量显示膜脂过氧化作用的程度，也是反映细胞膜系统受害的重要指标。由图3和表4可知，随着胁迫温度的降低，8份材料MDA含量变化基本表现为逐渐增加的趋势，但是在不同材料不同的胁迫温度下存在差异。其中在25～5℃段，各材料MDA含量变化均不大，差异不明显；在5～0℃段，沙生冰草MDA含量变化不显著，其它材料MDA含量升高幅度均达到显著水平；在0～-5℃段，除了细茎冰草、光穗冰草MDA含量差异性不显著外，其他材料MDA含量差异性均显著。从总体来看，在25～5℃段的胁迫下，各材料MDA含量变化较小，在5～-5℃段的胁迫下，各材料MDA含量变化逐渐增大，其中蒙古冰草（甘肃）和冰草MDA含量增加最大。

图3 8份冰草属植物幼苗在低温胁迫下丙二醛含量的变化Fig 3 The change of MDA content of 8 Agropyron Gaertn seedling under low temperature stress

表4 8份冰草属植物幼苗在低温胁迫下丙二醛含量的变化（nmol/g）Table4 The change of MDA content of 8 Agropyron Gaertn seedling under low temperature stress（nmol/g）

2.4 低温胁迫对8份冰草属植物幼苗过氧化物酶活性的影响

POD是植物膜脂过氧化的酶促防御系统中重要的保护酶，主要是起到酶促降解活性氧的作用〔2-5〕。由图4和表5可知，随着胁迫温度的降低，各材料POD活性基本表现为先升高后下降的趋势，但各材料POD活性最高峰出现的温度不同。其中沙生冰草、蒙古冰草（内清）、细茎冰草、光穗冰草和冰草POD活性最高峰出现在胁迫温度为5℃时，其它材料POD活性最高峰出现在胁迫温度为0℃时。从总体上看，在不同胁迫温度下，蒙古冰草（内清）与细茎冰草POD活性整体较高，且随着温度的变化其变化幅度较大。

图4 8份冰草属植物幼苗在低温胁迫下POD活性的变化Figure 4 The change of POD activity of 8 Agropyron Gaertn seedling under low temperature stress

表5 8份冰草属植物幼苗在低温胁迫下POD活性的变化Table5 The change of POD activity of 8 Agropyron Gaertn seedling under low temperature stress

2.5 低温胁迫对8份冰草属植物幼苗可溶性蛋白质含量的影响

植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，其含量是衡量总体代谢强弱的一个重要指标，可溶性蛋白含量越高，抗寒性越强。由表6和图5可知，在不同低温胁迫下，沙生冰草、蒙古冰草（甘肃）、光穗冰草和蒙古冰草（宁夏）可溶性蛋白含量，随温度的降低表现为先升高后降低的趋势，且均在5℃时出现最高峰，其中沙生冰草、光穗冰草可溶性蛋白含量在0℃、-5℃温度下可溶性蛋白含量差异不显著，蒙古冰草（甘肃）、蒙古冰草（宁夏）可溶性蛋白含量在0℃、-5℃温度下可溶性蛋白含量差异显著。其它材料可溶性蛋白含量，随温度降低表现为逐渐升高的趋势，在-5℃时达到了最大值。-5℃与其它温度下可溶性蛋白含量相比，其中蒙古冰草（内农）可溶性蛋白含量差异均显著，其余材料可溶性蛋白含量在0℃温度下差异不显著，与其它温度下可溶性蛋白含量差异显著。

图5 8份冰草属植物幼苗在低温胁迫下可溶性蛋白质含量的变化Figure 5 The change of soluble protein content of 8 Agropyron Gaertn seedling under low temperature stress

表6 8份冰草属植物幼苗在低温胁迫下可溶性蛋白质含量的变化Table6 The change of soluble protein content of 8 Agropyron Gaertn seedling under low temperature stress

2.6 隶属函数法综合评价抗寒性

采用隶属函数法，计算隶属度，根据隶属度对8份材料各项生理指标进行综合评价。隶属函数平均值越高，抗寒性越强〔1，6，7〕。获得综合评价值大小和抗寒强弱顺序：细茎冰草＞蒙古冰草（宁夏）＞蒙古冰草（内清）＞蒙古冰草（内农）＞冰草＞光穗冰草＞沙生冰草＞蒙古冰草（甘肃），见表7。

表7 各项指标平均数的隶属函数值Table7 The subordinate function value of average of the indicators

3 讨论

3.1 质膜透性与抗寒性的关系

植物低温下受伤害后，细胞膜受破坏，细胞内含物外渗增多，浸出液的电导率增高，植物的耐寒性降低，反之耐寒性提高。膜透性增大的程度与逆境胁迫强度有关，也取决于植物抗逆性的强弱〔8〕。吴万刚，何飞飞〔9〕等对低温胁迫下龙须草越冬伤害与保护酶活性的变化进行研究结果表明龙须草叶片细胞膜相对电导率随温度的下降而增加。本研究表明：冰草属8份材料在低温胁迫下相对电导率增大，而且不同材料的增大值有差异，从而表现出不同程度的抗寒性。证明质膜相对透性与植物的抗寒性成负相关，透性越大说明植物的体细胞破坏越严重，其抗寒性就越弱。

3.2 脯氨酸积累与抗寒性的关系

许多研究报道，植物在遭受环境胁迫时，体内的游离脯氨酸含量增加，这对于保持植物细胞内的水分、保护膜结构免受伤害有重要意义〔2〕。植物体内脯氨酸的增加有利于抵抗不良环境，脯氨酸在抗逆方面的作用可以概括为：作为细胞质渗压剂、酶和细胞结构的保护剂及自由基清除剂而起保护作用，从而增强植物的抗逆性。王芳〔10〕通过对芸香、常绿景天、侧金盏花三种不同抗寒类型植物体内脯氨酸含量的年季变化的测定，进一步证实了脯氨酸含量的年季变化与植物的抗寒性存在相关性。同时她也认为并不是任何情况下的脯氨酸含量增加对植物都有益处，在较低的长期冷害温度下，脯氨酸增加是植物伤害的结果，而在无严重冷害的锻炼温度下，脯氨酸积累则是一种适应性反应。从试验结果可以看出，冰草属8份材料脯氨酸含量变化趋势明显，变化的幅度不一样，受低温胁迫脯氨酸的含量都不同程度的增加，所以脯氨酸含量可以作为衡量冰草抵御寒冷的生理指标之一。

3.3 丙二醛与抗寒性的关系

植物处于逆境条件下，细胞内自由基的产生和清除的平衡遭到破坏，自由基的增加会导致细胞的伤害。孙清鹏〔11〕等人利用大叶相思和马占相思叶片进行低温胁迫，发现MDA含量总体呈增加趋势，与其受伤害的发展情况相一致，MDA含量随处理温度的降低而增加，说明膜脂过氧化程度加剧，与随温度下降其细胞膜透性增大、膜伤害程度增大的结果相一致。本试验获得低温处理条件下MDA含量总体呈上升的变化趋势，是因为植物受低温胁迫后，活性氧代谢的平衡被破坏，机体的抗氧化系统调节能力减弱，导致活性氧过剩，攻击膜系统，从而加剧了脂膜过氧化作用。

3.4 过氧化物酶与抗寒性的关系

POD是植物膜脂过氧化酶促防御系统中重要的保护酶，主要起到酶促降解H2O2的作用，从而使植物抵抗在逆境胁迫下代谢过程产生的有害物质对细胞的伤害，表现出一定的抗逆性。孙宗玖等〔12〕人认为冷害胁迫中SOD、POD活性通过共同增加来抵御逆境产生的伤害。本实验结果发现，冰草属8份材料的POD活性与抗寒性呈正相关关系，可以认为冰草属植物POD对低温反应敏感，能够保护其在低温环境中免受伤害。

3.5 可溶性蛋白与抗寒性的关系

可溶性蛋白含量与植物抗寒性之间存在密切关系，多数研究者认为：低温胁迫下，植物可溶性蛋白含量增加。可溶性蛋白亲水胶体性较强，能明显增强细胞持水力，可溶性蛋白质的增加可以束缚更多的水分，还可以减少原生质因结冰伤害而致死的机率。王毅等〔13〕认为，植物低温冷害引起细胞蛋白质的变化主要表现在可溶性蛋白的变化和产生抗冻蛋白。在经受低温锻炼的过程中，植物组织的可溶性蛋白质含量增加，被认为是植物产生抗寒性的重要过程。本实验中8份冰草属植物材料受到低温伤害，蛋白质含量都表现出了不同的变化，都有一个上升的过程，说明蛋白质在低温胁迫中起到了一定的抵抗作用。

4 结论

4.1 研究表明，随着胁迫温度逐渐降低，冰草属植物幼苗游离脯氨酸含量、可溶性蛋白质含量与过氧化物酶活性均能提高其抗寒性，其中游离脯氨酸含量的贡献最大。

4.2 采用隶属函数法对8份冰草属植物幼苗5项生理指标进行综合评价。测得抗寒能力强弱：细茎冰草＞蒙古冰草（宁夏）＞蒙古冰草（内清）＞蒙古冰草（内农）＞冰草＞光穗冰草＞沙生冰草＞蒙古冰草（甘肃）。

〔1〕闫伟红.冰草属和鹅观草属部分植物种质资源遗传分析〔D〕.博士学位论文，北京：中国农业科学院，2010.

〔2〕邵文鹏.几种常绿阔叶植物抗寒性研究〔D〕.硕士学位论文，山东农业大学，2009.

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〔6〕祁娟.披碱草属（Elymus L.）植物野生种质资源生态适应性研究〔D〕.博士学位论文，呼和浩特：中国农业科学院草原研究所，2009.

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The Influence of Physiological Characteristics and Cold Hardiness Evaluation of 8 Agropyron Gaertn Seedlings under Low Temperature Stress

Yan Wei-hong1，Ma Yubao1Zhang Jing-ran2，Wang Kai1Meng Qing-wei3
（1.Institute of Grassland Research of CAAS/Key Laboratory of Grassland Resources and Utilization，Ministry of Agriculture，Hohhot 010010；2.HOHHOT Vocational college，Hohhot 010010；3.Inner Mongolia Business and Trade Vocational college，Hohhot 010010）

Indoor low temperature incubator was adopted to simulate the low temperature stress，5 physiological indicators changes including conductivity，MDA content，POD activity，pro content and soluble protein content were determined about 8 Agropyron Gaertn seedlings from different area.The results show that with low temperature stress strengthening，pro content，soluble protein content and POD activity can improve cold resistance of 8 materials seedlings，but the largest contribution to pro content；By using subordinate function method for comprehensive evaluation，we know Agropyron trachycaulum＞Agropyron mongolicum（ningxia）＞Agropyron mongolicum（Inner Mongoliaqingshuihe）＞Agropyron mongolicum（Inner Mongolia agricultural university＞Agropyron cristatum＞Agropyron cristatum var.pectiniforme＞Agropyron desertorum＞Agropyron mongolicum（gansu）.

Agropyron Gaertn；low temperature stress；physiological indicators；cold resistance

S543+.9

A

2095—5952（2016）03—0022—09

2016-08-06

国家青年自然科学基金“不同纬度黄花苜蓿表观遗传多样性与低温胁迫下DNA表观遗传变化分析（31302017）”；中央级公益性科研院所基本科研业务费项目“黄花苜蓿遗传特性和低温下转录组与小RNA组分析（1610332015007、1610332014014）”。

闫伟红（1979- ），女，内蒙古赤峰人，博士，副研究员，主要从事牧草资源评价利用与育种，邮箱：yanweihong7037@163.com