过表达天山雪莲SikCDPK1基因提高转基因烟草耐低温能力的机制初探

田晓涵，庞学兵，祝建波，朱新霞

石河子大学 生命科学学院农业生物技术重点实验室，新疆 石河子 832000

过表达天山雪莲SikCDPK1基因提高转基因烟草耐低温能力的机制初探

田晓涵，庞学兵，祝建波，朱新霞

石河子大学 生命科学学院农业生物技术重点实验室，新疆 石河子 832000

钙依赖型蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases，CDPKs)在植物参与非生物胁迫信号响应中发挥着重要作用。本研究利用实时荧光定量PCR技术分析了天山雪莲钙依赖性蛋白激酶基因SikCDPK1在-4 ℃低温胁迫处理下的表达量，发现低温胁迫可以诱导天山雪莲内源SikCDPK1基因表达，且在处理3 h表达量迅速积累达到最高值。将SikCDPK1基因构建在由组成型CaMV35S强启动子控制的双子叶转化载体pCAMBIA2300上，利用农杆菌介导法转化烟草NC89，发现转基因烟草植株在低温胁迫后，耐低温能力明显增强；脯氨酸、可溶性蛋白含量及超氧化物歧化酶、过氧化物酶活性均高于非转基因烟草植株；丙二醛含量和相对电导率均低于非转基因烟草植株。上述研究结果表明，SikCDPK1基因可以通过积累渗透调节物质、增强抗氧化酶活性和维持细胞膜稳定性来提高植物的耐低温能力。

天山雪莲；SikCDPK1基因；低温；表达分析；转基因

低温、干旱、盐渍、洪涝等非生物逆境胁迫是制约农作物产量和品质的主要限制因素[1]，在长期的进化过程中，植物形成了复杂而又精细的信号转导途径，从而保护自身免受胁迫伤害。在植物细胞的信号转导过程中，钙离子作为第二信使，在植物生长发育和感知环境刺激的过程中扮演了非常重要的角色，其中钙依赖型蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases, CDPKs)是一类广泛存在于植物中的Ser/Thr类蛋白激酶，可不需钙调素而被钙信号直接激活，对植物感受钙信号并在细胞内放大信号和传递信号起关键作用[2]。自1982年在豌豆[3]中发现钙依赖蛋白激酶至今，陆续又在拟南芥[4]、水稻[5]、小麦[6]、烟草[7]、玉米[8]、黄瓜[9]等多种植物中发现，是植物中研究较多、了解较清楚的一类蛋白激酶。在转录水平上，CDPKs基因能够被多种胁迫信号诱导表达。过表达拟南芥AtCDPK1基因能明显提高转基因拟南芥在低温、高盐和ABA胁迫下的耐受能力[10]；低温能诱导胡杨PeCPK10基因的表达，PeCPK10在拟南芥中异源表达可以提高转基因拟南芥的抗寒性[11]；低温胁迫下，玉米ZmCPK1基因表达上调，ZmCPK1可以抑制冷胁迫诱导的Zmerf3基因的表达[12]；低温能诱导水稻OsCDPK13基因的表达，在OsCDPK13启动子区发现了低温应答元件LTRECOREATCORl5[13]。

天山雪莲(Sasussured involucrataKar.et Kir)能够在常年积雪、气候多变、昼夜温差悬殊的海拔2400 m至4100 m的山坡、山谷和石缝中生长，完成生活史，是优异的抗逆资源。本研究利用前期研究获得的天山雪莲SikCDPK1基因，构建组成型表达载体导入烟草，测定低温胁迫下转基因植株体内渗透调节物质、抗氧化酶活性和细胞膜稳定性变化，探讨在烟草中过表达天山雪莲SikCDPK1基因对低温逆境胁迫的响应机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

天山雪莲 (Sasussured involucrataKar.et Kir)，烟草(Nicotiana tabacumL.)品种NC89均由新疆石河子大学农业生物技术重点实验室保存。

1.1.2 菌株及试剂

大肠杆菌DH5α、农杆菌GV3101、植物表达载体pCAMBIA- 2300由本实验室保存。植物总RNA提取试剂盒购于北京艾德莱生物科技有限公司，cDNA合成试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司，限制性内切酶、T4DNA ligase购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司，SYBR GreenⅠMaster Mix购自罗氏诊断产品（上海）有限公司，其他试剂均为分析纯。引物合成由北京六合华大基因科技股份有限公司完成，本实验所用引物见表1，酶切位点用下划线标注。

表1 引物序列Tab. 1 Primer sequences

1.2 方法

1.2.1 低温胁迫下天山雪莲内源SikCDPK1基因表达分析

将天山雪莲无菌苗置于-4℃光照培养箱进行低温胁迫处理，分别取处理0（CK）、1、3、6、12、24 h叶片样品，液氮速冻，-70℃保存。分别提取对照和不同时间处理的雪莲RNA，以cDNA为模板，对SikCDPK1基因在低温胁迫下的表达进行分析。以天山雪莲看家基因GAPDH作为内参基因，按照Roche公司SYBR GreenⅠMaster Mix 试剂盒说明书操作，利用Light Cycler® 480Ⅱ PCR仪(Roche)进行扩增。反应程序为94℃预变性5min；94℃变性15s，62℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环。试验进行3次重复，取平均值，结果采用2-ΔΔCt法对数据进行分析。

1.2.2 pCAMBIA2300- SikCDPK1植物表达载体的构建

用BamHI和SalI分别双酶切植物表达载体pCAMBIA2300和阳性克隆载体pMD19-SikCDPK1，用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的基因和载体大片段。经T4DNA连接酶16℃过夜连接，重组子转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，经菌落PCR、双酶切鉴定，阳性克隆命名为pCAMBIA2300-SikCDPK1，电击法转入农杆菌GV3101。

1.2.3 烟草转化及分子鉴定

将含有质粒pCAMBIA2300-SikCDPK1的农杆菌通过叶盘法转化无菌烟草NC89，将侵染的烟草叶片置于含有80 μg﹒mL-1卡那霉素抗性的培养基上进行初步筛选，待叶边缘的愈伤组织逐渐分化出丛生芽，并长至2～3 cm左右时，置于卡那霉素抗性的生根培养基中，待根系发达后移入营养土中。经过15～20 d左右，改良CTAB法提取烟草基因组DNA，进行PCR检测，提取PCR阳性的转化株和受体烟草的总RNA，RT-PCR法检测SikCDPK1基因的转录水平。

1.2.4 转SikCDPK1基因烟草低温胁迫实验

选取生长旺盛、大小一致的野生型和T0代转基因烟草株系(line1、line2)各3株，放入-4℃的人工气候箱进行低温胁迫处理0、3、6、9、12h，然后将植株放入25℃培养箱恢复24h，记录各阶段烟草的形态变化，并在不同处理阶段分别取样，-70℃冷冻保存。

1.2.5 生理指标的测定

采用李合生[14]的方法测定野生型和转基因型株系烟草叶片在低温胁迫处理0、3、6、9、12h后的脯氨酸(Proline)、丙二醛(MDA)、可溶性蛋白含量、相对电导率及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性变化，实验进行生物学重复3次。

1.2.6 数据分析

实验数据采用SPSS17.0软件进行统计分析，以LSD法进行差异显著性分析，显著性水平设定为P＜0.05(显著水平)和P＜0.01(极显著水平)，采用Excel软件作图。

2 结果与分析

2.1 天山雪莲SikCDPK1基因受低温胁迫诱导表达

qRT-PCR结果表明，低温胁迫能够改变雪莲内源SikCDPK1基因的表达量(图1)。-4 ℃胁迫处理1 h，SikCDPK1基因表达量急速下降，而后表达量迅速上升，处理3h时达到最大值，为对照的5.8倍；随着处理时间的延长，表达量降为初始水平；12h时表达量降至最低，仅为对照表达量的9.6 %；24h时表达量又开始上升，为对照的1.79倍，推测SikCDPK1基因在低温胁迫中起作用。本研究中胁迫处理1 h的表达量要低于未胁迫的表达量，这可能是由于天山雪莲在-4℃环境呈现应激反应导致。

图1 低温胁迫下SikCDPK1基因的表达分析Fig. 1 Analysis of SikCDPK1 gene expression under cold stress

2.2 转基因烟草的获得及鉴定

将SikCDPK1基因插入到由组成型CaMV35S启动子控制的表达载体pCAMBIA2300上(图2)。SikCDPK1基因特异引物PCR检测阳性转化株(图3)。提取鉴定为阳性植株叶片中的RNA，进行半定量表达分析，结果表明SikCDPK1基因在过表达烟草中可以正常转录(图3)，其中泳道9和10分别命名为Line1、Line2，用于后续实验。

图2 载体pCAMBIA2300-SikCDPK1构建简图Fig. 2 Figure of pCAMBIA2300-SikCDPK1 vector

图3 转SikCDPK1基因烟草的PCR和RT-PCR检测Fig.3 PCR and RT-PCR identification of the SikCDPK1 transgenic plants

2.3 转基因烟草耐低温能力分析

2.3.1 低温胁迫下转基因烟草表型变化

将野生型和表达量高的转基因株系放入-4℃人工气候箱内进行低温胁迫处理。如图4 A所示，室温生长状态下，野生型和转基因株系没有明显表型差异；置于-4℃培养箱3 h后，野生型烟草叶片轻度下垂，表现出轻微冷害特征，转基因烟草无明显表型变化(图4 B)；低温胁迫6 h后，野生型烟草冷害症状愈发明显，叶片中度萎蔫，出现伤斑，而转基因烟草依旧未出现明显变化(图4 C)；低温胁迫9 h后，野生型烟草基本完全萎蔫，水渍状明显，只有顶部小叶芽还有生命体征，而转基因烟草此时叶片轻微疲软(图4 D)；低温胁迫12 h后，野生型烟草完全萎蔫，而转基因烟草叶片卷曲并下垂，萎蔫严重(图4 E)；室温恢复24 h后，野生型烟草无明显恢复现象，而转基因烟草叶片开始伸展，逐渐恢复(图4 F)。

2.3.2 低温胁迫下转基因烟草生理指标变化

对低温胁迫不同处理时间的野生型和转基因烟草分别进行了脯氨酸、可溶性蛋白、MDA含量，POD、SOD活性和相对电导率的测定。

图4 野生型和转基因烟草低温胁迫下的形态特征Fig. 4 Phenotypes of WT, line 1 and line 2 under cold stress

图5 低温胁迫对野生型(WT)和转SikCDPK1基因烟草部分生理指标的影响Fig. 5 Effect of cold stress on physiological contentis of WT and SikCDPK1 tobacco

结果表明，低温处理前，野生型和转基因型烟草脯氨酸含量差别不大，随着低温胁迫时间的增加，脯氨酸含量呈现上升—下降—上升—下降的趋势，转基因植株脯氨酸含量高于野生型(图5 A)，在3 h和9 h之间达到极显著水平。说明低温胁迫下，转基因烟草可以积累更多的脯氨酸，从而提高植株的耐冷性。

低温处理前，野生型和转基因型烟草可溶性蛋白含量差别较小，随着低温胁迫时间的增加，转基因烟草叶片可溶性蛋白含量增加幅度大于野生型（图5 B），在6 h后达到极显著水平；室温恢复24 h后，野生型烟草可溶性蛋白含量仍在增加，而转基因烟草开始逐渐下降。说明在低温胁迫下，转基因烟草叶片可溶性蛋白含量增加使细胞液浓度增大，从而增强了植株的抗寒性。

低温处理前，野生型和转基因型烟草MDA含量差别不大，随着低温胁迫时间的延长，野生型和转基因烟草MDA含量均呈现上升趋势（图5 C），转基因植株MDA含量低于野生型，在9 h时达到极显著水平；在室温恢复阶段MDA含量开始下降。说明低温胁迫下转基因植株细胞膜受损程度较轻。

在正常生长状态下，野生型和转基因烟草POD和SOD活性无明显差异(图5 D, E)，随着低温胁迫时间的延长，野生型和转基因烟草POD活性持续上升，在冷处理6 h达到最高值，分别为初始的2.16倍和2.29倍，随后开始下降，在恢复阶段又开始上升；而SOD活性处于持续上升状态，转基因烟草SOD活性增长幅度高于野生型，在恢复24 h后开始下降。说明低温胁迫下，转基因烟草拥有更高的POD和SOD活性，对细胞膜能起到保护作用，从而增强植株的抗寒性。

随着胁迫时间的延长，野生型和转基因烟草相对电导率均呈明显上升趋势(图5 F)，在室温恢复24 h后转基因烟草相对电导率开始下降，而CK仍保持上升趋势；整个过程转基因植株相对电导率显著低于野生型，其中第6 h和第9 h达到极显著水平。说明低温胁迫下，转基因植株细胞膜透性变化相对较小，胞质外渗程度较低，细胞膜受损较轻。

本试验结果显示SikCDPK1基因显著提高了转基因烟草的耐低温能力。CDPKs基因家族成员较多，且不同CDPK基因成员对低温胁迫的响应模式可能不同，后续还需要发掘并研究CDPK低温信号转导途径的关键分子、筛选出下游有价值的与SikCDPK1相互作用的蛋白等，从而更好的揭示SikCDPK1基因的抗逆分子机制。

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：TIAN Xiaohan, PANG Xuebing, ZHU Jianbo, et al. Effect of over-expression ofSaussurea involucrataSikCDPK1gene on improving cold tolerance in transgenic tobacco [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016, 22(6)

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关键词：沿阶草；OjDREB基因；耐盐性；烟草

Effect of over-expression ofSaussurea involucrata SikCDPK1gene on improving cold tolerance in transgenic tobacco

TIAN Xiaohan, PANG Xuebing, ZHU Jianbo, ZHU Xinxia
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Sasussured involucrataKar.et Kir;SikCDPK1; low temperature; expression analysis; transgenosis

田晓涵，庞学兵，祝建波，等. 过表达天山雪莲SikCDPK1基因提高转基因烟草耐低温能力的机制初探[J]. 中国烟草学报，2016,22（6）

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田晓涵（1990—），硕士，研究方向为环境生物技术，Email：723745781@qq.com

朱新霞（1968—），Email：302641316@qq.com

2016-06-12