益气复生方对小鼠胃癌脾气虚证的代谢组学影响

何娜娜，胡　兰，陈　音

(新疆医科大学附属中医医院肿瘤科，乌鲁木齐　830011)



益气复生方对小鼠胃癌脾气虚证的代谢组学影响

何娜娜，胡兰，陈音

(新疆医科大学附属中医医院肿瘤科，乌鲁木齐830011)

目的探讨益气复生方对小鼠胃癌脾气虚证的代谢组学影响。方法20只健康雄性小鼠，140 d白醋+2-乙基亚硝胺干预条件下建立胃癌脾气虚证小鼠模型，取存活的15只小鼠中表型和体质量相近的12只，随机分为对照组和实验组，每组6只。实验组小鼠给予40 g/kg体质量益气复生方灌胃，对照组给予相同质量的蒸馏水，均连续14 d处理。经变量重要性投影(VIP)的参数评价可能的小鼠血清生物标志物，对两组小鼠血清生物标志物进行核磁共振(1H-NMR)检测，观察两组小鼠相关代谢产物的变化。结果实验组小鼠经过益气复生方的治疗后体质量、摄食量、活动度增加，大便部分成型，毛发由枯槁恢复为正常黑棕色，有光泽。对照组小鼠与建模成功时无明显变化。经变量重要性投影(VIP)的参数评价可能的胃癌脾气虚证小鼠血清生物标志物包括3-羟基丁酸、低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白、甲硫氨酸、谷氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、葡萄糖、甘油三酯、不饱和脂肪酸和胆碱。实验组小鼠血清1H-NMR 谱中代谢产物中3-羟基丁酸、甲硫氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺的含量低于对照组(P<0.05)，低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白、谷氨酸、甘油三酯、不饱和脂肪酸和胆碱的含量则高于对照组(P<0.05)，葡萄糖的含量与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论益气复生方对小鼠的胃癌脾气虚证具有显著的治疗效果，其作用可能是通过调控能量代谢水平及脂质代谢水平的来实现的。

益气复生方；小鼠；代谢组学；血清

胃癌是发生率居于第四位的恶性肿瘤疾病，并且胃癌的致死率在所有恶性肿瘤中居于第二位，胃癌已经成为威胁人类健康的一个严重问题[1]。在我国，胃癌也是常见的恶性肿瘤之一，胃癌发病率居于各种恶性肿瘤的第二位，也是致死率最高的一类恶性肿瘤[1-2]。在我国每年均有近17万人死于胃癌，占恶性肿瘤死亡人数的23.02%,占据了将近1/4的比例[3]。据统计，每年全国各大医院查出2万人以上的新增胃癌患者[4]。由此可见，胃癌已经成为严重危害我国人民群众身体健康的疾病。陈静等[5]研究表明，胃癌前疾病、 癌前病变、 胃癌与脾气虚有着紧密的联系，脾气虚证贯穿胃癌发生发展的始终。长期的临床观察表明，益气复生方能有效地治疗脾气虚证，在改善胃肠道反应方面效果显著。

代谢组学(metabonomics)是一种通过对生物体内代谢产物进行定量分析来探索生理改变与代谢物含量变化的相关性，属于系统生物学的分支，主要研究小分子物质(相对分子质量<1 000)。通过检测一系列样品的NMR 谱图，再结合模式识别方法，可以判断出生物体的生理状态，并找出与之相关的生物标志物。代谢组学所反映的是人体对外界干扰因素在代谢水平上的应答反应，与中医中的“证”的意义相近，为解释中医中的“证”提供了一种方法。施旭光等[6]开展了补中益气汤治疗慢性浅表性胃炎脾气虚证的代谢组学的研究。本研究采用核磁共振技术检测胃癌脾气虚证小鼠血清代谢物的变化，旨在探讨胃癌脾气虚相关代谢途径，为益气复生方的临床使用提供科学的依据。

1　材料与方法

1.1实验动物健康雄性小鼠12只,体质量(20±2) g，由新疆医学实验动物中心提供，于普通级动物房饲养，室内温度保持为(22±2)℃，相对湿度保持在30%～40%，12 h/12 h明暗交替环境下培养，自由饮水，自由进食。

1.2药材、仪器与试剂益气复生方的制备：抓取药材炒白术15 g、黄芪20 g、肉豆蔻15 g、党参20 g、茯苓20 g、八月札15 g等药物，加8倍量的水,浸渍1 h，武火煮至沸腾，之后使用文火煎煮，过滤，将滤渣收集，再加6倍量的水煎煮30 min，过滤后将滤液合并，浓缩至每毫升药液含有1 g生药。Bruker AVANCE Ⅲ500 MHz 全数字化超导核磁共振仪；氘水(D2O)、叠氮钠( NaN3)均由美国 Sigma 公司生产。模型构造药物：白醋，2-乙基亚硝胺。

1.3动物模型建立与分组8周龄的健康雄性小鼠20只，在相对湿度30%～40%，温度(22 ±2)℃，参照文献[7]脾气虚胃癌病证结合动物模型法，构建脾气虚胃癌证模型。取20只NIH小鼠，进行48 h饥饿处理，用白醋(酸度3.5 g/100 mL)对小鼠进行灌胃，按照每天15 mL/kg体质量的标准进行处理10 d，随后按照每天10 mL/kg体质量的标准进行处理10 d，再以2-乙基亚硝胺对小鼠进行灌胃处理，按照每天2.8 mg/kg体质量的标准处理120 d[7-8]。小鼠普遍出现体质量、摄食量和运动量减小、毛发枯槁、腹部膨大、大便变溏的现象，显示造模成功。其中5只小鼠因反应较重死亡，取剩余存活的15只小鼠中表型和体质量相近的12只，随机分为对照组和实验组，每组6只。实验组小鼠给予40 g/kg体质量益气复生方灌胃，对照组给予相同质量的蒸馏水，均连续14 d处理。

1.4变量重要性投影(VIP)的参数评价自变量的VIP>1，说明自变量对因变量的解释有重要的作用；VIP=0.5～1，说明自变量对因变量的解释的重要性不明确，需要增加样本或根据别的条件进行判断；VIP<0.5，则说明自变量对因变量的解释基本没有意义。以VIP>1 的自变量建立统计回归模型，VIP>1和P<0.05作为标准筛选胃癌脾虚证的生物标记物。

1.5观察指标建模成功后实验组小鼠给予40 g/kg体质量益气复生方灌胃，对照组给予相同质量的蒸馏水，均连续14 d处理后对两组小鼠进行心脏取血，收集其血液 0.5～1 mL，收集的血液在4℃静置60 min凝固，然后进行离心(3 500 rpm/min，5 min，4℃)处理。

1.6核磁共振分析使用预饱和的1D NOESY 脉冲序列压制水峰，采样点数64 K，采集次数128次。对于血清样品用Carr -Purcell -Meibom -Gill脉冲序列来抑制血清中的脂蛋白和蛋白质中较宽的共振信号；弛豫延迟时间为4 s；总的回波时间为100 ms；谱宽为10 kHz；通过使用线宽为0.3 Hz 的指数窗函数进行傅立叶变换。脂类、氨基酸类、酮类物质、糖类等物质均为血清中的代谢物，通过对图谱进行傅立叶变换、相位调整、基线校正及去偏置等处理，结合化合物归属表及相关数据库，鉴定实验所检测到的代谢物峰谱的归属。使用MestReNova 6.1软件对所获谱图进行手动相位、基线校正等操作，再根据乳酸的甲基共振双重峰来定标核磁共振谱的化学位移。

2　结果

2.1两组小鼠治疗后一般情况比较实验组小鼠经过益气复生方的治疗后体质量有所回复，摄食量增加，活动度增加，大便部分成型，毛发由枯槁恢复正常黑棕色，有光泽。对照组小鼠与建模成功时无明显变化。

2.2两组小鼠血清的1H-NMR代谢物谱分析变量重要性投影(VIP)的参数评价可能的胃癌脾气虚证小鼠血清生物标志物包括3-羟基丁酸、低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白、甲硫氨酸、谷氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、葡萄糖、甘油三酯、不饱和脂肪酸和胆碱。实验组小鼠血清1H-NMR 谱中代谢产物中3-羟基丁酸、甲硫氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺的含量低于对照组(P<0.05)，低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白、谷氨酸、甘油三酯、不饱和脂肪酸和胆碱的含量则高于对照组(P<0.05)，葡萄糖的含量与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1、图1。

图1　小鼠血清1H-NMR图

代谢产物1H-NMRVIP对照组实验组3-羟基丁酸1.17(d)6.02926.84±216.09128.99±26.23*VLDL0.88(m)5.30152.91±24.56301.75±75.78*甲硫氨酸2.13(s)2.02128.99±26.23100.06±9.82*谷氨酸2.03(m)1.5322.68±3.4141.03±4.48*缬氨酸1.03(d)1.1847.24±6.0923.61±4.41*谷氨酰胺2.45(m)1.1143.77±3.7525.61±1.42*葡萄糖5.14(d)1.2849.46±11.3575.19±19.06甘油三酯4.37(m)1.073.55±1.7510.50±1.80*不饱和脂肪酸5.13(m)1.7236.4±4.8165.34±12.55*胆碱3.22(s)1.4373.04±11.5599.62±6.21*

注：VLDL，极低密度脂蛋白。与对照组比较，*P<0.05。s，单峰；d，双重峰；t，三重峰；m，多重峰。

3　讨论

益气复生方由党参、肉豆蔻、沙棘、黄芪、苦豆子、八月札等组成。白术、豆蔻有健脾燥湿、醒脾开胃的功效；党参、黄芪具有“益胃气”的功效，可以强健胃脾，大补元气；配合补益药，从而实现健脾益气、复生中气之效[9]。长期的临床经验证明益气复生方对于胃癌脾气虚证具有良好的治疗效果，可以有效提高胃癌患者的生存质量[10-11]。本研究也发现经过益气复生方治疗后的小鼠与未经治疗的小鼠血清代谢水平差异有统计学意义。但是益气复生方治疗胃癌脾气虚证的代谢机理并不清楚。本研究通过建立胃癌脾气虚证的小鼠模型，采用核磁共振技术(NMR)的代谢组学方法探索了益气复生方治疗小鼠胃癌脾气虚证的代谢途径及治疗过程中相关生物标志物的变化。

本研究表明胃癌脾气虚过程中，机体能量代谢水平降低，对照组胃癌脾气虚小鼠血清中的葡萄糖水平较低，经过益气复生方治疗后的实验组小鼠血清中的葡萄糖水平提高；在脂质代谢方面，3-羟基丁酸水平在血清中的含量有所降低，而不饱和脂肪酸、甘油三酯、VLDL等代谢物含量上升，体内脂质代谢恢复正常。在氨的运输、存储过程中谷氨酰胺发挥着重要的作用。谷氨酰胺水平在一定程度的降低意味着氨代谢的改变。在体内甲基转移反应过程中，胆碱是一种发挥重要作用的物质，其水平的升高意味着体内甲基转移反应的加强。本研究结果显示，经过益气复生方的治疗之后，甲硫氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺代谢物的水平降低，谷氨酸代谢物的水平升高，表明益气复生方治疗对于小鼠体内的氨基酸代谢也有着重要的影响。胃癌脾气虚证患者在糖类、氨基酸和脂类代谢等代谢上存在紊乱状况。本研究表明益气复生方对于胃癌脾气虚证造成的代谢紊乱的调控回复主要体现在能量代谢水平和脂类代谢水平上。

综上所述，益气复生方对于小鼠胃癌脾气虚证的治疗作用，可能通过糖类脂类氨基酸类等各种小分子物质发挥作用，然而通过调控能量代谢水平及脂质代谢水平的途径是最具可能性的。本研究在小鼠血清中发现的10种相关生物标志物为发现潜在治疗靶点提供了新的可能。

[1]Cervantes A,Roda D,Tarazona N,et al.Current questions for the treatment of advanced gastric cancer[J].Cancer Treat Rev,2013,39(1):60-67.

[2]Kanat O,O′Neil BH.Metastatic gastric cancertreatment:a little slow but worthy progress[J].Med Oncol,2013,30(1):1-10.

[3]邹文斌,李兆申.中国胃癌发病率及死亡率研究进展[J].中国实用内科杂志,2014,34(4):408-415.

[4]张静.中药对癌症患者恶病质状态的影响[J].中国中西医结合杂志,2000,20(11):871.

[5]陈静,赵爱光,曹妮达,等.胃癌前疾病、癌前病变、胃癌与脾气虚证的研究进展[J].中华中医药学刊，2013,31(7):65-68.

[6]施旭光,邹忠杰,吴美音,等.补中益气汤治疗慢性浅表性胃炎脾气虚证的代谢组学研究[J].广州中医药大学学报，2014,31(4):504-509.

[7]张宏,林代华,余成浩,等.脾气虚胃癌病证结合动物模型的建立[J].四川动物，2007,26(3):13-15.

[8]彭成,罗亮.过食酸味所致脾气虚机理的实验研究[J].山东中医学院报,1989,13(6):13-14.

[9]韩靓.益气复生方通过ERK/MAPK通路抑制人结肠癌细胞株HCT116侵袭转移的实验研究[D].乌鲁木齐：新疆医科大学,2012.

[10]任小娟,王昕宇,陆明,等.益气复生方对荷瘤小鼠血清D-乳酸影响的实验研究 [J].新疆中医药，2012,30(6):7-8.

[11]邓皖利,吕书勤,任小娟,等.益气复生方对胃癌原位移植瘤小鼠肠黏膜屏障的影响[J].世界华人消化杂志,2013,21(11):951-956.

(本文编辑周芳)

Effect of Yiqifusheng recipe on metabonomics of spleen-qi deficiency Syndrome in mice with gastric cancer

HE Nana,HU Lan,CHEN Yin

(Department of Tumor,Affiliated Traditional Hospital Xinjiang Medical University,Urumqi 830011,China)

ObjectiveTo explore the metabonomic effects of Yiqifusheng recipe on spleen-qi deficiency syndrome of mice with gastric cancer.Methods20 healthy male mice were used to establish the model of spleen-qi deficiency syndrome and gastric cancer processed with white vinegar and 2-ethyl-N-nitrosamines for 140 days.12 mice with similar phenotype and body mass were selected from survival groups (15 mice),then randomly divided into control and experimental groups,six mice per group.The mice in experimental group were given 40 g/kg Yiqifusheng recipe,and mice in the control group were received the same quantity of distilled water for 14 days.Possible serum biomarkers were evaluated by variable importance projection (VIP) parameters,and the serum biomarkers of mice were detected by hydrogen proton nuclear magnetic resonance spectroscopy (1H-NMR) in two mice groups,and the changes of metabolites related to the serum biomarkers were observed.ResultsThe mice in the experimental group were treated with Yiqi Huansheng Recipe.The body weight,food intake and activity of the mice were increased,the stool was partially formed and the hair was returned from normal to dark brown.While,there was no significant changes in the mince of control group.The serum biomarkers of mice with spleen-qi deficiency syndrome and gastric cancer mice evaluated by VIP were 3-hydroxybutyric acid,LDL/VLDL,methionine,glutamic acid,valine,glutamine,glucose,triglycerides,unsaturated fatty acids and choline.1H-NMR spectra of mice serum metabolites showed that:the content of 3-hydroxybutyric acid ,methionine,valine,glutamine in the experimental group were lower than those in the control group (P<0.05),however,the content of LDL/VLDL,glutamic acid,triglycerides,unsaturated fatty acids and choline were higher in the experimental group than those in the control group (P<0.05).The content of glucose had no significant effect on mice serum metabolites (P>0.05) in the1H-NMR spectrum.ConclusionYiqifusheng have a significant therapeutic effect on mice spleen deficiency syndrome and gastric cancer.its regulatory mechanism may be through the regulation of energy metabolism and lipid metabolism.

Yi-Qi-Fu-Sheng Recipe; Mice; Metabonomics; Serum

新疆维吾尔自治区青年自然科学基金(2012211B36)

何娜娜(1982-)，女，硕士，主治医师，研究方向：中医肿瘤内科。

陈音，女，博士，主任医师，硕士生导师，研究方向，中医肿瘤内科，E-mail：15199019689 chenying713@163.com。

R735.2

A

1009-5551(2016)11-1432-04

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.11.021

2016-04-23]