瓜蒌薤白半夏汤对心肌梗死大鼠Wnt信号通路中β-链蛋白表达的影响※

周 菁 张 焱 张 倩

(上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院心内科，上海 200437)



瓜蒌薤白半夏汤对心肌梗死大鼠Wnt信号通路中β-链蛋白表达的影响※

周 菁 张 焱1张 倩1

(上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院心内科，上海 200437)

目的 观察瓜蒌薤白半夏汤对心肌梗死大鼠Wnt信号通路中β-链蛋白(β-catenin)表达的影响。方法 结扎大鼠左冠状动脉前降支建立大鼠心肌梗死模型，造模成功的大鼠随机分为心肌梗死模型组和瓜蒌薤白半夏汤组，每批次每组10只。心肌梗死模型组大鼠给予0.9%氯化钠注射液2 mL/次，每日1次灌胃，瓜蒌薤白半夏汤组大鼠给予浓煎中药2 mL/次，每日1次灌胃。分别干预1、5、10、15 d共4个批次。另取健康清洁级雄性SD大鼠10只，未行手术治疗，留为假手术组。免疫组化的方法检测β-catenin，IPWIN软件检测β-catenin表达率。结果 心肌梗死模型组及瓜蒌薤白半夏汤组大鼠的β-catenin表达在心肌梗死后1、5、10、15 d均较假手术组升高，并且这2组大鼠在心肌梗死后分别干预5、10、15 d的β-catenin表达与假手术组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。与心肌梗死模型组大鼠比较，心肌梗死后给予瓜蒌薤白半夏汤干预1、5、10、15 d 4批次大鼠的β-catenin表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论 大鼠的Wnt /β-catenin信号通路可被心肌梗死激活。短期使用瓜蒌薤白半夏汤未见到显著的促进心肌梗死大鼠心肌细胞β-catenin表达的作用。

疾病模型, 动物; 心肌梗死；中药疗法; 心血管药物(中药)；钙黏着糖蛋白类

冠心病心肌梗死多属中医学胸痹心痛、真心痛范畴。近几十年来，随着人民生活水平的不断提高，冠心病的发病率逐年上升。统计数据发现多数冠心病心肌梗死患者合并有肥胖、血脂代谢紊乱、高血压等危险因素[1-2]。通过中医辨证，这类患者通常具有胸闷如窒、腹部肥满松软、苔腻、脉滑等痰湿痹阻症状，治疗拟化痰开痹为主，临床疗效显著[3-6]。然而有关化痰中药促进梗死后心肌修复作用的实验研究却相对较少。本研究选用《金匮要略》记载之瓜蒌薤白半夏汤为代表方，观察大鼠急性心肌梗死造模成功后给予瓜蒌薤白半夏汤治疗1、5、10、15 d的Wnt信号通路中β-链蛋白(β-catenin)表达情况，以分析化痰中药是否具有促进梗死后心肌修复的作用。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂、仪器

1.1.1 药物 瓜蒌薤白半夏汤按《金匮要略》记载之原方瓜蒌12 g、薤白9 g、半夏9 g配方。自动煎药机统一煎药，控制时间及加水量，浓煎至生药含量为1 g/mL。

1.1.2 试剂 山羊抗大鼠β-catenin一抗、二抗均由圣克鲁斯生物技术(上海)有限公司提供。

1.1.3 实验仪器 光学显微镜：日本OLYMPUS公司。

1.2 动物、造模与分组

1.2.1 动物 SD大鼠90只，雄性，清洁级，体质量(250±20) g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：11400700038123。

1.2.2 造模 参照文献[7-8]中的造模方法，取健康清洁级雄性SD大鼠80只，适应性饲养观察1周，以3%水合氯醛腹腔麻醉(10 mL/kg)，插入气管，连接微型呼吸机行正压呼吸，前胸消毒后，在第3～4肋间打开胸腔，暴露心脏，结扎左冠状动脉前降支。结扎前后记录Ⅱ导联心电图，以结扎部位以下心肌变苍白、搏动减弱且出现J点明显抬高为造模成功。逐层缝合胸壁，待动物恢复自主呼吸后，停止辅助呼吸，缝合皮肤。

1.2.3 分组 术后将存活大鼠80只随机分为心肌梗死模型组和瓜蒌薤白半夏汤组。每批次每组各10只。分别进行0.9%氯化钠注射液或瓜蒌薤白半夏汤灌胃干预1、5、10、15 d 4批次实验。另取健康清洁级雄性SD大鼠10只，进行常规饲养，未行手术治疗，留为假手术组。

1.3 方法与步骤

1.3.1 药物干预 心肌梗死模型组大鼠给予0.9%氯化钠注射液2 mL/次，每日1次灌胃；瓜蒌薤白半夏汤组大鼠给予浓煎中药2 mL/次，每日1次灌胃。分别完成干预1、5、10、15 d共4批次实验，每批次大鼠均在干预结束后第2 d处死。

1.3.2 免疫组化检测 摘取大鼠心脏，应用4%多聚甲醛将大鼠心肌梗死区心肌组织固定，固定24～48 h后行石蜡包埋、切片。免疫组化实验步骤：①将石蜡切片放入二甲苯中浸泡脱蜡；②分别用无水乙醇、90%乙醇、80%乙醇浸泡，自来水冲洗，纯水浸泡脱二甲苯；③放入H2O2中加盖避光浸泡前后，予磷酸盐缓冲液(PBS)加Tween-20(PBST)清洗，灭活内源性过氧化物酶活性；④抗原修复30 min；⑤PBST清洗数次后滴加10%山羊血清，孵育60 min，滴加一抗β-catenin，置入4 °C冰箱过夜；⑥PBST清洗后滴加二抗，置37 °C室内孵育30 min；⑦PBST清洗后二氨基联苯胺(DAB)显色；⑧苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。封片后1～2 h即可读片。

1.3.3 图像分析系统 光镜检测β-catenin的表达情况。运用IPWIN软件分析系统读取β-catenin表达率。选取图片中β-catenin表达出的棕色区域，获得表达数值，再除以整张图片中心肌组织的表达数值，获得β-catenin的表达率。

2 结 果

各组大鼠心肌梗死后干预1、5、10、15 d β-catenin表达率比较 见表1。

组 别n1d5d10d15d假手术组100.01814±0.005860.01814±0.005860.01814±0.005860.01814±0.00586心肌梗死模型组100.02106±0.017430.05332±0.01715*0.07093±0.03313*0.04902±0.02152*瓜蒌薤白半夏汤组100.02132±0.01452△0.05479±0.02244*△0.07497±0.02260*△0.05672±0.03477*△

与假手术组同期比较，*P<0.01；与心肌梗死模型组同期比较，△P>0.05

由表1可见，心肌梗死造模成功后，心肌梗死模型组、瓜蒌薤白半夏汤组β-catenin表达率在心肌梗死后干预5、10、15 d均较假手术组升高(P<0.01)。瓜蒌薤白半夏汤组干预1、5、10、15 d β-catenin表达率与心肌梗死模型组同期比较均稍有增高，但差异无统计学意义(P>0.05)。大鼠心肌梗死后其β-catenin的表达呈现先上升再下降的趋势，峰值在干预10 d时出现。

3 讨 论

以往人们普遍认为心脏是不可再生的器官。心肌梗死后损伤和变性的心肌细胞经巨噬细胞吞噬后被瘢痕组织取代，失去相应的功能。近年来，有关心肌梗死区本身的修复过程及心肌细胞再生的实验研究已引起学者的普遍关注，促进梗死区的愈合以提高心肌梗死患者存活质量，是心肌梗死治疗的新思路。临床上，针对痰湿痹阻型的心肌梗死患者，联合以瓜蒌薤白半夏汤为基础方的中药汤剂化痰通痹治疗，往往恢复较快。《素问·痹论》曰：“心痹者，脉不通。” 《景岳全书》曰：“痰涎本皆血气，若化失其正，则脏腑损，津液败，而血气即成痰涎。”因此，如果血瘀痹阻可导致“真心痛”心脉不通，那么，“痰涎本皆血气”，痰浊痹阻也可导致“真心痛”心脉不通。心脉不通，心失所养，胸闷如窒，气短乏力，心悸喘促，究其病机乃心脏受损，痰瘀气虚，只有化痰通痹，祛瘀生新，才能心血再生，气助行血。因此，针对痰湿痹阻型的心肌梗死患者，联合中药化痰通痹、祛瘀生新十分重要。研究出其作用机制则更加有利于临床推广应用。

针对心脏新生的研究，国外研究发现Wnt广泛分布于心脏，调节心脏的发育与生长。Wnt信号通路中β-catenin参与心脏内细胞增殖、分化和凋亡过程，也参与心肌梗死后一系列的病理生理变化[9-13]。β-catenin是一种多功能的蛋白质，功能主要为介导细胞间黏附，参与细胞增殖、迁移及相关基因的表达。研究发现，发生心肌梗死后1周，无β-catenin表达的小鼠的梗死区发生破裂，而对于非梗死区破裂的野生型小鼠来说，β-catenin却极易检测[14]，提示β-catenin对梗死区细胞黏附起重要作用[15]，缺乏β-catenin，梗死心脏就难以维持心室壁的完整性。此外，赵琦峰等[16]研究发现，心肌梗死后肌纤维母细胞、血管内皮细胞等细胞增殖、迁移至梗死区。肌纤维母细胞样细胞分泌细胞外基质，并具有一定的收缩能力，在梗死区内规则排列，与心内外膜相连接，能防治梗死区的膨胀和扩张，有助于心功能的维持。并且研究发现，肌纤维母细胞在发生梗死的大鼠心脏中增殖和迁移过程中伴随着β-catenin的高表达，β-catenin表达在肌纤维母细胞的迁移阶段，说明Wnt-1 /β-catenin通路可能参与了心肌梗死后梗死区愈合过程中肌纤维母细胞的排列过程。同时该研究还发现，在梗死区新生血管内皮细胞、平滑肌细胞胞质内有Wnt-1、β-catenin高表达，7、10 d时表达最明显，说明Wnt-1、β-catenin可能参与了梗死区新生血管内皮细胞、平滑肌细胞的增殖和迁移。

本研究发现，心肌梗死后5 d时 β-catenin的表达已开始增加；10 d时，其表达水平达高峰；15 d后表达减弱，与赵琦峰[16]及陈丽君[17]研究报道相符。陈丽君[17]的研究发现大鼠急性心肌梗死后β-catenin的表达变化进程正好符合急性心肌梗死后颗粒组织形成的时间进程，也提示该信号分子可能参与调控了心肌梗死后心肌组织愈合过程中肌纤维母细胞以及血管内皮细胞的增殖和迁移等细胞修复活动。因此，大鼠心肌梗死后β-catenin表达的增加可增强细胞间的黏附作用，维持梗死后心室壁的完整性，同时有助于促进梗死区肌纤维母细胞及血管内皮细胞的增殖、迁移，从而发挥促进心肌修复再生的作用，验证了Wnt /β-catenin信号通路在发生心肌梗死后被激活的表现。另一方面，给予瓜蒌薤白半夏汤干预治疗后大鼠β-catenin的表达虽然符合心肌梗死后的变化规律，但与心肌梗死模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)，提示短期应用瓜蒌薤白半夏汤没有看到显著的加强梗死后心肌细胞黏附及促进相关细胞增殖、迁移的作用。下一步或许可以通过适当延长大鼠灌服中药的时间，或联合观察Wnt信号通路其他上下游因子来探讨化痰中药发挥促进梗死后心肌修复的作用机制。

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(本文编辑：董军杰)

Study on the expression of Beta-catenin after using Gualou-Xiebai-Banxia decoction in rats Wnt signaling pathway after myocardial infarction

ZhouJing*,ZhangYan,ZhangQian.

*DepartmentofCardiology,YueyangHospitalofIntegrativeChineseandWesternMedicineAffiliatedtoShanghaiUniversityofTCM,shanghai200437

Objective To explore the expression of beta-catenin after using Gualou-Xiebai-Banxia decoction in rats Wnt signaling pathway after myocardial infarction. Methods The left anterior descending coronary arteries of SD rats were ligated to establish myocardial infarction models. All rats with myocardial infarction were divided into model group (n=10) and Gualou-Xiebai-Banxia decoction group (n=10). The rats in control group were treated with 2 mL of 0.9% NaCl per day. The rats in Gualou-Xiebai-Banxia decoction group were treated with 2mL of concentrated decoction per day. There were four different duration of treatments specifically 1 d, 5 d, 10 d and 15 d. Another 10 healthy male SD rats were used as sham group. Beta-catenin was detected by immunohistochemical method. IPWIN software was used to detect the expression of beta-catenin. Results The expressions of beta-catenin 1 d, 5 d, 10 d and 15 d after myocardial infarction were increased in model and Gualou-Xiebai-Banxia decoction groups were higher than those in sham group, and the statistical differences existed in the durations of 5 d, 10 d and 15 d after myocardial infarction (P<0.01). There were no statistical differences on the expressions of beta-catenin 1 d, 5 d, 10 d and 15 d after myocardial infarction between model and Gualou-Xiebai-Banxia decoction groups (P>0.05). Conclusion The Wnt/β-catenin signaling pathway in the rats may be activated by myocardial infarction. The short-term use of Gualou-Xiebai-Banxia decoction did not significantly increase the expression of beta-catenin in rats after myocardial infarction.

Disease model; Animal; Myocardial infarction; Traditional Chinese herbs therapy; Cardiovascular drugs; Cadherins

※ 项目来源：国家自然科学基金资助项目(编号：81202668)

1 上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院内科，上海 200437

周菁(1979—)，女，主治医师，博士。从事中西医结合防治冠心病的研究。

10.3969/j.issn.1002-2619.2016.08.018

R-332;R289.5;R542.220.531；R341.3

A

1002-2619(2016)08-1191-04

2015-11-27)