X射线诱变选育嗜酸氧化亚铁硫杆菌及其对难处理金矿浸出的研究

剡 倩　张苗苗　郭晓鹏　李文建　陆 栋（中国科学院近代物理研究所　兰州 730000）

2（中国科学院大学　北京 100049）

X射线诱变选育嗜酸氧化亚铁硫杆菌及其对难处理金矿浸出的研究

剡 倩1，2张苗苗1郭晓鹏1，2李文建1陆 栋1
1（中国科学院近代物理研究所兰州 730000）

2（中国科学院大学北京 100049）

为了探讨嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans， At.f）经X射线诱变后对难处理金矿的预氧化效果和金浸出率的影响，采用不同剂量的 X射线诱变处理At.f，通过微生物学方法和相关指标的测定，获得优良的At.f菌株。结果显示，经X射线辐照至吸收剂量为450 Gy时，At.f对Fe的浸出率达50.24%，矿石预氧化效果比原始菌株提高44%，金浸出率可达86.68%，是直接氰化时金浸出率的2.1倍。X射线能使At.f发生明显变异，使诱变菌的氧化活性、对难处理金矿的预氧化效果和金浸出率均得到提高。

嗜酸氧化亚铁硫杆菌，X射线诱变，生物氧化，难处理金矿

CLCQ691.5， TL99

随着社会发展和人们生活水平的提高，金的需求量逐年增加，易处理金矿逐渐减少，合理开发难处理金矿迫在眉睫［1］。虽然全球金矿储量丰富，但大部分为难处理金矿，这一情况在中国尤其明显。2014年对全国金矿进行的系统调查表明，我国金矿储量约为8 648.47 t［2］，其中30%为难处理金矿［1］。矿石预氧化是开发难处理金矿的核心技术，细菌氧化法是利用微生物对包裹金的硫化物等进行生物氧化从而释放金颗粒，具有工艺简单、易操作、投资少、对环境友好、能耗少等优点［3-6］，在对低品位、难选冶金矿资源的开发利用方面有着广阔的工业应用前景［7］。

嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans， At.f）是细菌氧化法中最主要的菌种，属于化能自养型微生物，可通过氧化二价铁离子（Fe2+）和还原性硫化合物（S0）获得能量，并利用自然环境的低pH值产生从Fe2+到烟酰胺嘌呤二核苷酸的反向电子流［8-10］。但是由于 At.f野生型菌株生长周期太长，对环境中各种离子较为敏感，从而严重制约了生物氧化的实际工业化应用。因此，寻求有效的诱变技术，选育性状优良的菌种对于生物氧化法处理金矿具有重要的意义［11］。目前，较为常见的应用于At.f的选育方法有紫外线、γ射线和亚硝基胍处理等［12-16］，而将X射线用于At.f诱变改良的研究尚未见报道。本研究使用X射线对嗜酸氧化亚铁硫杆菌进行诱变，通过对菌种氧化活性、预氧化效果和浸出率等指标的测定，以期获得 X射线辐照诱变At.f的最适物理参数，选育优良At.f菌株，为高效生物浸矿菌种的获得提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1At.f

At.f标准株ATCC19859由兰州大学生命科学学院惠赠。

1.1.2培养基

种子培养基：9 K培养基［17］为A、B混合液。

A液：（NH4）2SO43.0 g；MgSO4·7H2O 0.5 g；K2HPO40.5 g；KCl 0.1 g；Ca（NO3）20.01 g；去离子水600 mL，pH=1.8，121 ℃灭菌30 min。B液：FeSO4·7H2O 44.78 g；去离子水400 mL，pH=1.8，用孔径为0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，灭菌后将A和B混合。

浸矿培养基：0 K培养基，同A液。

1.1.3矿石样品

矿样取自陇南阳山金矿，主要成分为硫化矿和黄铁矿，粒度50目。

1.2方法

1.2.1细菌培养方法

按10%接种量将At.f ATCC19859接种于种子培养基中，置150 r/min旋转摇床上30 ℃振荡培养至液体颜色变为棕红色即生长至对数期。

1.2.2无铁细胞悬液制备

吸取种子菌液，于8 000 r/min条件下离心20 min，去上清液得到菌体沉淀，加无菌水以调节细菌浓度至108/mL，备用。

1.2.3X射线诱变处理及筛选

将无铁细胞悬液置于直径为 35 mm 的无菌平皿中，在瓦里安Varian Clinac 21EX Platinum 直线加速器（VARIAN，美国）上进行辐照处理，辐照能量为6 MV，剂量率为6 Gy/min，靶源距100 cm，吸收剂量分别为 90、180、270、360、450、540、630和720 Gy。其中，对照组不做任何辐照处理。将经过诱变处理的菌液立即置于 4 ℃冰箱中冷藏12 h，按体积分数10%接种量分别接种到种子培养基中，在30 ℃、150 r/min的条件下培养至颜色变为棕红色（第一代传代时间长，需要 3～7 d，之后传代时间变短，一般在30 h左右），筛选生长周期短、对 Fe2+氧化率高的突变菌株。

1.2.4菌种的矿石驯化

对各个剂量辐照后的菌液进行矿石驯化，第一次驯化时加少量FeSO4·7H2O，接入对数期菌液，矿石粉末加入量为1%，置于最佳生长条件（30 ℃，pH =1.8，150 r/min）下培养。每隔1 d测定其pH值，并观察颜色变化确定细菌的生长状况，每次测完后调节pH=1.8。每隔7 d转接一次菌，矿浆浓度按1%的梯度从1%到5%递增。当最后细菌完全适应矿石条件时开始金矿的生物预氧化实验。

1.2.5矿石生物预氧化

将矿石于200 ℃干燥灭菌2 h，按矿浆浓度5%加入浸矿培养基中，调整pH 值至1.8。分别接入不同剂量辐照后的菌液，30 ℃、150 r/min 振荡培养28 d，培养基因蒸发而损失的水分用无菌水进行补充，最后测定Fe的浸出率。

1.2.6金矿的浸出

将生物预氧化后的矿石分别用 pH=1.5的蒸馏水和pH=11的蒸馏水洗涤两次后烘干，加入0.4%的氰化钠，称重、记录。置于30 ℃、150 r/min摇床中氰化48 h，取出补加蒸发掉的水，静置4 h，用原子吸收分光光度法测定金浓度。通过溶液中金含量和矿石中金含量的比值来确定金浸出率。同时测定直接氰化时的金浸出率。

1.2.7分析方法

氧化活性的分析采用亚铁离子氧化法，菌液中Fe2+的浓度用重铬酸钾容量法测定：

式中：RO-Fe2+表示 Fe2+氧化率；［Fe2+］1为原培养基中Fe2+浓度（g/mol）；［Fe2+］2为培养后培养基中Fe2+浓度（g/mol）；V1为原培养基消耗重铬酸钾溶液的体积（mL）；V2为培养后培养基消耗重铬酸钾溶液的体积（mL）。

细菌数的测定采用血球记数器，矿石成分分析采用扫描电子显微镜X-射线能量色散谱方法（FEI 6 CHANNEL BSD AMPLIFIER MK3.1）和原子吸收光谱仪方法（瓦里安AA240原子吸收光谱仪），矿石预氧化程度采用测量铁浸出率法，铁的浸出率采用德国耶拿ZEEnit®700P火焰石墨炉原子吸收光谱仪测定，金的浸出率采用瓦里安AA240原子吸收光谱仪进行分析，pH值的测定采用 PHS-3C 型精密酸度计。

所有实验重复3次，统计分析由 SPSS 15 软件完成，统计图采用 Origin8.0软件绘制。

2　结果与分析

2.1矿样成分分析

利用扫描电子显微镜 X射线能量色散谱方法（SEM-EDS）和原子吸收光谱法对矿石的主要成分进行分析，结果表明该矿样中Au含量为15.67 g/t，其他主要成分有23.87% Fe，2.01% As，3.73% Al 和5.44% Si。可见该矿样是一种高砷的品位很低的贫矿。阳山金矿［18］是我国最大的卡林型-类卡林型金矿，金以细微形式包裹在黄铁矿和硫化物中，使用氰化物直接浸出难度较大。

2.2X射线诱变对At.f的影响

将原始At.f用X射线诱变处理，吸收剂量分别为90、180、270、360、450、540、630和720 Gy，照射之后便进行计数，不同剂量的 X射线对原始At.f的致死率见图1。从图1可以看出，随着吸收剂量的增加，细菌的致死率增加。当吸收剂量在0～360 Gy时，致死率随着剂量增加急剧增长，之后增长缓慢。半致死剂量为 270 Gy；当吸收剂量为540 Gy时，致死率达94%。

把经 X射线照射的菌液置于4 ℃冰箱避光放置12 h，然后接入9 K培养基置于摇床培养，反复重新接种 3次后测其氧化活性和生长曲线，其中OD450用来表征细菌的生长程度，培养基中 Fe2+的氧化程度表征其氧化活性。具体见图2和图3。

细菌的生长曲线和氧化活性相一致。360 Gy吸收剂量下的细菌氧化活性最高，提前进入对数期，且氧化活性比原始菌株高11%。270 Gy吸收剂量下的细菌氧化活性也高于原始菌株。在致死率50%～80%，细菌的氧化活性最高。450 Gy吸收剂量下的细菌从第一次传代培养到第三次传代培养时间均非常长，第三次传代培养时，7 d后才进入对数期。630、720 Gy吸收剂量下对细菌而言是非常大的剂量，总活性皆明显低于原始菌株。

2.3突变菌株对阳山金矿的预氧化效果

在进行金矿的预氧化之前，以原始菌株为对照，分别采用各个剂量辐照后的 At.f进行矿石驯化试验。结果表明，细菌可以在有矿石存在的条件下很好地生长，且最佳矿浆浓度为 5%。把经过驯化的细菌接入浸矿培养基中进行矿石预氧化，每隔 7 d取样并测定Fe的浸出率，用浸矿培养基补充因取样而损失的浸出液，结果如图4所示。总共浸矿时间28 d，Fe的最终浸出率如图5所示。

由图4可见，各个吸收剂量下的细菌对矿石的氧化效果在各个时间点均高于原始菌株，并且随着时间的增长，Fe的浸出率也增加，且浸出速率在7～21 d时间内较低，之后大幅增加。吸收剂量为540 Gy的菌液对Fe的浸出率在各个时期均高于其他剂量。180 Gy辐照后的菌液在第7～14 d内浸出速率较快，之后下降；450 Gy辐照后的菌液在浸矿开始时速率较快，第7 d后开始下降，第7～14 d的浸出率基本没有增加。在0～180 Gy和270～540 Gy范围内，浸出率随着吸收剂量的增加而增加，剂量超过540 Gy之后，Fe的浸出率下降，这与细菌总氧化活性低相一致。

由图5可见，所有经X射线辐照后的突变体对Fe的浸出率均高于原始菌株，其中540 Gy吸收剂量下的突变体对 Fe的浸出率最高，比原始菌株高76%；450 Gy吸收剂量下的突变体对Fe的浸出率达50.24%，比原始菌株提高 44%；显著性检验得p＜0.05，两者皆与原始菌株对Fe的浸出率存在显著性差异。360 Gy吸收剂量下的突变体对矿石的氧化效果比原始菌株高22.1%，这与前面所述360 Gy吸收剂量下细菌总氧化活性比原始菌株高相一致。从180～540 Gy吸收剂量下的细菌对矿石的预氧化效果提高均比较明显，说明存活率在30%～80%的吸收剂量都是可选的。

2.4金矿浸出结果

以未经过生物氧化的矿样为对照，用经各个剂量X射线辐照诱变过的At.f氧化后的矿样进行氰化浸金的实验研究。诱变前后的At.f对矿样中金浸出效果的影响见图6。

由图6可见，经过生物预氧化矿样的金浸出率均高于未经生物预氧化的矿样。各个吸收剂量下的细菌对矿样预氧化效果的影响与对金浸出率的影响大概一致。450 Gy筛选到的突变体，金浸出率最高，达到86.68%，浸出率是直接氰化时的2.1倍，显著性检验得p＜0.01，表明两者之间存在明显差异。当吸收剂量为540 Gy时，金浸出率为57.7%，相对于直接氰化提高了39.5%，与预氧化效果高相一致。X射线诱变可引起At.f变异，使其对金浸出率有明显提高。

3　讨论与总结

常用于微生物诱变育种的电离辐射有X射线及γ射线，X射线是一种高能电磁辐射［19］，它波长较短，穿透能力较强，照射在生物机体的分子上时产生电离作用，通过直接效应和间接效应［20-21］使机体发生不同程度的生理、病理和生化等方面的改变，例如引起细胞膜损伤和DNA 损伤等，其中未修复的DNA损伤往往引起突变。大量研究涉及到利用物理辐射对微生物进行选育，如徐晓军等［22］用紫外线辐照诱变氧化亚铁硫杆菌，结果表明，紫外线辐照能够使浸矿细菌氧化亚铁硫杆菌产生明显的变异，提高氧化亚铁硫杆菌菌种的活性，诱变氧化亚铁硫杆菌对黄铜矿的浸出率比原始氧化亚铁硫杆菌提高46%以上。本研究使用X射线诱变At.f取得的结果表明，所有经过辐照诱变的菌株对矿样中 Fe的浸出率都高于原始菌株。其中360 Gy吸收剂量下的突变体比原始菌株对Fe的浸出率提高了25%；450 Gy吸收剂量下的突变体对Fe的浸出率提高了44%；540 Gy吸收剂量下的突变体对矿样中Fe的浸出率比原始菌株提高76%。结果表明，X射线辐照能够使At.f发生有利突变，是一种良好的菌种选育方法。当菌种的致死率在30%～80%之间时，细菌对矿石的预氧化效果均明显高于原始菌株，这为今后优良菌种选育提供了重要的吸收剂量范围。

此外，细菌预氧化对矿样中金的浸出效果优于直接氰化浸出，且辐照处理对矿样的金浸出率也具有一定程度的影响，所有经过X射线辐照的At.f都提高了难处理金矿的金浸出率，其中最值得一提的是当吸收剂量为450 Gy时，金浸出率的提高非常显著，达到86.68%，是直接氰化时金浸出率的2.1倍。可见细菌氧化法可有效地提高难处理金矿的金浸出率，在直接氰化之前进行矿石预氧化非常有必要，而且菌种性能直接影响金浸出率。说明X射线是一种有效的高效浸矿菌种选育方法。

本研究还表明生物氧化法适合阳山金矿一类的卡林型金矿等低品位难处理金矿的浸出。

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Study on breeding Acidithiobacillus ferrooxidans induced by X-ray irradiation and bioleaching of refractory gold ore

YAN Qian1，2ZHANG Miaomiao1GUO Xiaopeng1，2LI Wenjian1LU Dong1
1（Institute of Modern Physics， Chinese Academy of Sciences， Lanzhou 730000， China）
2（University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China）

To study the influence of Acidithiobacillus ferrooxidans （At.f） mutated by X-ray on the biooxidation and bioleaching of refractory gold ores， X-ray was used to irradiate At.f strains at different doses， and more efficient strains were screened by microbiology methods and the measurement of relevant indicators. Compared with the original strain， the bioleaching ratio of iron by the mutants after irradiation at 450 Gy was 50.24%， namely 44% increased， and the bioleaching ratio of gold reached 86.68%-two folds than gold direct cyanidation leaching. It is proved that X-ray irradiation is an outstanding way to breed mutants of high bioleaching ratio of iron and gold strains of At.f.

Acidithiobacillus ferrooxidans， X-ray irradiation， Biooxidation， Refractory gold ores

YAN Qian （female） was born in December 1992 and graduated from Northwest Normal University in June 2014. Now she is a master candidate in Institute of Modern Physics， Chinese Academy of Sciences， majoring in biophysics and focusing on basic study on microbial mutation breeding. E-mail： qiany@impcas.ac.cn

Ph.D. LI Wenjian， professor， E-mail： wjli@impcas.ac.cn

9 May 2016， accepted 22 June 2016

Q691.5，TL99

10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.050401

中国科学院西部之光人才培养计划项目（Y306010XB0）资助

剡倩，女，1992年12月出生，2014年6月毕业于西北师范大学，现为中国科学院近代物理研究所硕士研究生，生物物理学专业，主要从事微生物诱变育种基础研究，E-mail： qiany@impcas.ac.cn

李文建，博士，研究员，E-mail： wjli@impcas.ac.cn

初稿2016-05-09；修回2016-06-22

Supported by Western Talent Training Program of the Chinese Academy of Sciences， China（No. Y306010XB0）