超声波处理对北五味子多糖抗氧化活性的影响

汪艳群，孟宪军

（沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866）

超声波处理对北五味子多糖抗氧化活性的影响

汪艳群，孟宪军

（沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866）

利用超声波对北五味子多糖进行改性，从而提高其抗氧化活性。以羟自由基（·OH）及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率为指标，考察了超声波处理功率、超声波处理时间对北五味子多糖抗氧化活性的影响。结果表明：超声波处理功率、处理时间对北五味子多糖抗氧化活性有显著影响。最佳超声波处理功率为330 W、处理时间为20 min。经此条件处理后，·OH清除率由74.34%提高到87.05%，半抑制浓度（IC50）为10.7 mg/mL；DPPH自由基清除率由84.43%提高到95.05%，IC50＜2 mg/mL。适当的超声波处理可以提高北五味子多糖的抗氧化活性。

北五味子；多糖；抗氧化；超声波

五味子（Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.）又名五梅子、玄及、会及、山花椒等，木兰科多年生落叶藤本。五味子为药食两用物质，其应用已有2 000多年的历史，被列为新资源食品，可用于生产药品、保健品、化妆美容品和多种饮品、食品添加剂等。20世纪90年代以来，许多学者从五味子水提液中分离得到了多糖，已经发现五味子多糖具有保肝、抗疲劳、增强免疫系统功能、清除氧自由基、抗衰老、降血糖、降血脂等生理活性[1-5]。近年来，多糖的生物活性和化学多样性引起关注。多糖结构复杂，适当的结构改变能提高多糖的生物活性。多糖改性的方法有化学、物理和生物手段[6]。超声波处理是近年来新兴的一种改性方法，其通过超声空化作用引起的机械效应、热效应和水分子裂解产生的自由基效应对多糖的结构产生影响，从而改变多糖的生物活性[7]。与其他改性方法相比，超声波处理具有节能省时，无化学试剂和有机溶剂污染等优点[8]。目前，针对北五味子多糖进行改性的研究报道较少。本研究将纯化后的北五味子多糖用超声波处理，对其进行改性，考察超声波处理对其体外抗氧化活性的影响，为提高北五味子多糖生物活性提供理论依据和借鉴，为超声波在多糖改性中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

北五味子干果由辽宁辽阳五味子种植基地提供，沈阳药科大学中药学院天然药化教研室鉴定为木兰科植物五味子（Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.）的干燥果实。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美国Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

TU-1810紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；DK-S26电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；玻璃层析柱、HL-2恒流泵 上海青浦沪西仪器厂；透析袋（截留分子质量为14 000 u） 上海莲冠生物化工有限公司；GDC-TQ/ZS/4中试型智能控制超声波多功能提取机组 济宁金百特生物机械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 北五味子多糖的分离纯化工艺流程

北五味子干果→破碎→40 目筛→水提→乙醇沉淀→乙醚、丙酮洗涤→脱蛋白→聚酰胺柱层析→透析→冷冻干燥→北五味子精多糖备用

称取一定量五味子粉末按照料液比为1∶40（m/V）、提取时间为5 h、提取温度为90 ℃进行提取。提取后用旋转蒸发仪将滤液浓缩至原体积的约1/5，加4 倍于提取液体积的95%乙醇，搅拌均匀后4 ℃条件下静置12 h。将静置液抽滤，所得沉淀用乙醚、丙酮、无水乙醇依次洗涤，滤干。将上述粗多糖配成20%的粗多糖溶液，将三氯乙酸-正丁醇溶液（1∶10，V/V）与粗多糖溶液等体积混合，移入分液漏斗中振荡10 min后静置1 h，分液取下层溶液，再与三氯乙酸-正丁醇溶液等体积混合，如此重复4 次。脱蛋白后进行聚酰胺柱层析，上样体积500 mL，多糖质量浓度为2 mg/mL，流速1.2 mL/min，蒸馏水洗脱，收集洗脱液。洗脱10 h后将收集的组分真空浓缩，冻干后再进行一次柱层析。之后进行透析，自来水流水透析3 d，蒸馏水透析2 d，每3～4 h换一次蒸馏水，透析后冷冻干燥得白色絮状北五味子精多糖，备用。

1.3.2 超声波处理对北五味子多糖抗氧化活性的影响

1.3.2.1 超声波处理功率对北五味子多糖抗氧化活性的影响

超声波频率为28.5 kHz，处理时间为20 min，北五味子多糖质量浓度为10 mg/mL。采用功率为0、220、330、440、550、660 W的超声波分别处理20 min，测定其清除羟自由基（·OH）的能力。

超声波处理功率对北五味子多糖清除DPPH自由基活性影响实验：设定北五味子多糖质量浓度为2 mg/mL，其他处理条件相同。实验重复3 次。

1.3.2.2 超声波处理时间对北五味子多糖抗氧化活性的影响

超声波频率为28.5 kHz，功率为330 W，北五味子多糖质量浓度为10 mg/mL。超声波分别处理0、2.5、5、10、20、40 min，测定其清除·OH的能力。

超声波处理时间对北五味子多糖清除DPPH自由基活性影响实验：设定北五味子多糖质量浓度为2 mg/mL，其他处理条件相同。实验重复3 次。

1.3.2.3 超声波最佳条件处理后北五味子多糖抗氧化活性的测定

超声波频率为28.5 kHz，功率为330 W，处理时间为20 min。北五味子多糖溶液质量浓度分别为2.5、5、10、15、20 mg/mL，处理后测定其清除·OH的能力。

设定北五味子多糖溶液质量浓度分别为2、4、6、8、10 mg/mL，其他处理条件相同，对清除DPPH自由基的能力进行测定。对照为未经超声波处理的北五味子多糖。实验重复3 次。

1.3.3 抗氧化活性的测定[9]

1.3.3.1 ·OH清除能力的测定

取1.5 mmol/L邻二氮菲溶液1.0 mL，加0.2 mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲溶液2.0 mL，充分混匀后，加1.5 mmol/L硫酸亚铁溶液1.0 mL，加入样品溶液1.0 mL，每加一管立即混匀，加质量分数为0.01% H2O2溶液1.0 mL。整个反应体系体积共6 mL。反应在37 ℃条件下恒温水浴锅中进行，准确反应1 h后，在536 nm波长处测定吸光度，记为AX。损伤组中用1.0 mL去离子水代替样品溶液；未损伤组中用2.0 mL去离子水代替样品溶液和H2O2溶液。以VC作为参照物。按式（1）计算样品对·OH的清除率。

式中：AX为样品组吸光度；A0为未损伤组吸光度；A1为损伤组吸光度。

1.3.3.2 DPPH自由基清除能力的测定

在2 mL 2×10－4mol/L的DPPH乙醇溶液中加入2 mL样品溶液，混匀后避光反应30 min，在517 nm波长处测定吸光度AX。对照组A1中用2 mL去离子水代替样品溶液，对照组A2中用2 mL无水乙醇代替2 mL DPPH乙醇溶液。以VC为参照物。按式（2）计算样品对DPPH自由基的清除率。

1.4 数据统计分析

采用Excel 2013处理软件，各组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 超声波处理对北五味子多糖抗氧化活性的影响

2.1.1 超声波处理功率对北五味子多糖抗氧化活性的影响

图2 超声波处理功率对北五味子多糖清除DPPH自由基活性的影响Fig.2 Effect of ultrasonic power on DPPH radical scavenging activity of polysaccharides from Schisandra chinensis

由图1可知，超声波处理显著增强了北五味子多糖清除·OH的活性，超声波功率在330 W时，多糖的·OH清除率最高，达到48.63%，功率超过330 W后，·OH清除率缓慢下降，趋于平稳。由图2可知，超声波功率在330 W时对DPPH自由基的清除率最大，随后缓慢下降，直至趋于平稳，并且超声波处理对北五味子多糖清除DPPH自由基活性的增强作用更显著，功率为220 W时，清除率就达到71.70%，未经超声波处理的多糖，其清除率为63.03%。这可能是由于适宜功率的超声波处理有利于北五味子多糖的适度降解和溶解度的提高[10]，增强DPPH自由基清除能力；功率太大又可能引起多糖分子交联，使其抗氧化活性降低[11]。超声波对聚合物的降解作用与超声声强、处理时间、温度等有关，一般来说，超声波功率越大超声声强越高，通常超声声强越高，降解作用越强，但达到一定程度后，进一步增强声强，降解作用增强不明显，这在Zhong Kui等[12]对裂褶菌胞外多糖，Zhang Lifen[13]和Sun Yujing[14]等对苹果果胶、全反式-β-胡萝卜素的超声波降解研究中均有报道。因此，选择超声波处理功率为330 W，对提高五味子多糖的抗氧化活性较为适宜。

2.1.2 超声波处理时间对北五味子多糖抗氧化活性的影响

图3 超声波处理时间对北五味子多糖清除·OH活性的影响Fig.3 Effect of ultrasonic treatment time on hydroxyl radical scavenging activity of polysaccharides from Schisandra chinensis

图4 超声波处理时间对北五味子多糖清除DPPH自由基活性的影响Fig.4 Effect of ultrasonic treatment time on DPPH radical scavenging activity of polysaccharides from Schisandra chinensis

由图3、4可知，当超声波处理时间在20 min内时，随超声波处理时间的延长，北五味子多糖对·OH的清除率提高，0～20 min时，·OH清除率从42.91%上升到48.30%，DPPH自由基清除率从63.03%上升到72.15%；之后，随超声波处理时间的延长，自由基清除率趋于稳定。超声波处理可以使多糖降解，分子质量和黏度降低，一般单糖组成和糖苷键类型不发生变化[15]，也没有支链反应的发生[16]，还有报道超声波处理使多糖α-螺旋数量增多[15]，这些变化可能与改性后的多糖抗氧化活性、抑制肿瘤细胞增殖活性提高有关[15,17-18]。也有研究表明，多糖链的降解存在最低降解分子质量（Mmin，即超声波不能对其进行降解的低多糖分子质量）[19]。因此，推测在固定超声波功率为330 W的情况下，20 min的处理时间已使多糖长链能发生的断裂基本完成，分子质量的降低有助于自由基清除率的提高；进一步延长处理时间，已经断裂的多糖链不再变化，故而清除率趋于稳定。合理控制超声波处理时间，在一定程度上可以提高五味子多糖清除自由基的活性。

2.1.3 超声波最佳条件处理后北五味子多糖的抗氧化活性

图5 北五味子多糖质量浓度对其清除·OH活性的影响Fig.5 Effect of polysaccharide concentration on hydroxyl radical scavenging activity of polysaccharides from Schisandra chinensis

由图5可知，在实验质量浓度范围内，所有的北五味子多糖溶液都表现出明显的自由基清除能力，并且随北五味子多糖质量浓度的上升，·OH的清除率随之提高，表现出了明显的剂量依赖性。经超声波处理后的北五味子多糖其·OH清除能力较未经超声波处理的多糖显著提高（P＜0.05），且二者的·OH清除率均高于VC对照组。经超声波处理后的北五味子多糖其·OH清除率最高为87.05%，IC50为10.7 mg/mL；未经超声波处理的五味子多糖其·OH清除率最高为74.34%，IC50为13.2 mg/mL。

DPPH自由基是一种很稳定的以氮为中心的自由基，广泛用于各种抗氧化剂清除自由基能力的研究中。抗氧化剂通过转移传递电子或氢原子给DPPH来中和其自由基。因此，对DPPH自由基的清除效果可以反映抗氧化剂的供氢能力[20]。由图6可知，北五味子多糖具有很强的DPPH自由基清除能力，未经超声波处理的北五味子多糖，和超声波处理后的多糖在质量浓度为2 mg/mL条件下其DPPH自由基清除率即可达到63.03%和72.72%，这提示北五味子多糖可能具有较强的供氢能力，但二者的清除能力均不如VC对照组。当质量浓度为10 mg/mL时，超声波处理可以显著提高北五味子多糖清除DPPH自由基能力，DPPH自由基清除率由84.43%提高到95.05%。

图6 北五味子多糖质量浓度对其清除DPPH自由基活性的影响Fig.6 Effect of polysaccharide concentration on DPPH radical scavenging activity of polysaccharides from Schisandra chinensis

超声波处理能提高多糖的抗氧化活性，这与王振斌等[11]对无花果多糖，Zhang Henan等[18]对桑黄菌丝体多糖，李岱等[21]对柴胡多糖，Yang Bao等[22]对龙眼果皮多糖，涂宗财等[23]对荷叶多糖，严碧歌等[24]对麦冬多糖的研究结果均一致。超声波处理能提高北五味子多糖的自由基清除能力，推测与多糖内能引起抗氧化活性的分子内氢键有关。据报道，高分子质量的壳聚糖结构致密，导致能引起羟基和氨基活性的分子内氢键的作用变弱；而低分子质量的壳聚糖结构松散，对分子内氢键的影响就相对温和[25]。超声波处理使五味子多糖发生降解，将高分子质量的多糖变为分子质量低一些的大小适宜的碎片，使其对氢键的影响减小，从而表现出更显著的抗氧化活性。

3 结 论

适当的超声波处理可以显著提高北五味子多糖的抗氧化活性。超声波处理功率、处理时间对多糖抗氧化活性有显著影响（P＜0.05）。在实验参数范围内，最佳超声波处理功率为330 W，处理时间为20 min。经此条件处理后，·OH清除率最高，为87.05%，IC50为10.7 mg/mL；DPPH自由基清除率最大，可达到95.05%，IC50＜2 mg/mL。

[1] 李巧云, 居红芳, 翟春. 五味子粗多糖提取工艺的研究[J]. 食品科学, 2004, 25(5): 105-109. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2004.05.021.

[2] 孟宪军, 李冬男, 汪艳群, 等. 响应曲面法优化五味子多糖的提取工艺[J]. 食品科学, 2010, 31(4): 111-115. DOI:10.7506/spkx1002-6300-201004025.

[3] 陈文静, 季宇彬. 五味子多糖药理作用的研究进展[J]. 食品与药品, 2007, 9(12): 66-67. DOI:10.3969/j.issn.1672-979X.2007.12.023.

[4] 高晓旭, 孟宪军, 李继海. 北五味子活性多糖降脂减肥作用的研究[J].食品工业科技, 2008, 29(11): 248-250.

[5] 马育轩, 范越, 张晓娟, 等. 五味子多糖干预胰岛素抵抗大鼠作用研究[J]. 中医药信息, 2014, 31(2): 7-8.

[6] LIU Y Y, WANG Q, LIU H Z. Modification of cell wall polysaccharides from Saccharomyces cerevisiae[J]. Chemical Industry and Engineering Progress, 2009, 28(4): 686-691. DOI:10.1016/0385-6380(88)90101-X.

[7] 洪胜, 潘利华, 罗建平. 生物多糖超声波辅助提取研究进展[J]. 食品工业科技, 2011, 32(8): 481-484.

[8] KUIJPERS M W A, KEMMERE M F, KEURENTJES J T F. Calorimetric study of the energy efficiency for ultrasoundinduced radical formation[J]. Ultrasonics, 2002, 40(1/8): 675-678. DOI:10.1016/s0041-624x(02)00197-x.

[9] 汪艳群, 孟宪军, 刘丽, 等. 五味子废渣中多糖的分离及体外抗氧化活性[J]. 食品与生物技术学报, 2013, 32(2): 163-168. DOI:10.3969/ j.issn.1673-1689.2013.02.009.

[10] ZHOU C S, YU X J, ZHANG Y Z, et al. Ultrasonic degradation, purification and analysis of structure and antioxidant activity of polysaccharide from Porphyra yezoensis Udea[J]. Carbohydrate Polymers, 2012, 87(3): 2046-2051. DOI:10.1016/j.carbpol.2011.10.026.

[11] 王振斌, 孙亚钊, 郭强. 超声波对无花果多糖抗氧化活性的影响[J].食品工业科技, 2013, 34(3): 97-99.

[12] ZHONG K, ZHANG Q, TONG L T, et al. Molecular weight degradation and rheological properties of schizophyllan under ultrasonic treatment[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2015, 23: 75-80. DOI:10.1016/j.ultsonch.2014.09.008.

[13] ZHANG L F, YE X Q, DING T, et al. Ultrasound effects on the degradation kinetics, structure and rheological properties of apple pectin[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2013, 20(1): 222-231. DOI:10.1016/j.ultsonch.2012.07.021.

[14] SUN Y J, MA G P, YE X Q, et al. Stability of all-trans-βcarotene under ultrasound treatment in a model system: effects of different factors, kinetics and newly formed compounds[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2010, 17(4): 654-661. DOI:10.1016/ j.ultsonch.2009.12.005.

[15] ZHU Z Y, PANG W, LI Y Y, et al. Effect of ultrasonic treatment on structure and antitumor activity of Mycelial polysaccharides from Cordyceps gunnii[J]. Carbohydrate Polymers, 2014, 114: 12-20. DOI:10.1016/j.carbpol.2014.07.068.

[16] POINOT T, BENYAHIA K, GOVIN A, et al. Use of ultrasonic degradation to study the molecular weight influence of polymeric admixtures for mortars[J]. Construction and Building Materials, 2013, 47: 1046-1052. DOI:10.1016/j.conbuildmat.2013.06.007.

[17] YU X J, ZHOU C S, YANG H, et al. Effect of ultrasonic treatment on the degradation and inhibition cancer cell lines of polysaccharides from Porphyra yezoensis[J]. Carbohydrate Polymers, 2015, 117: 650-656. DOI:10.1016/j.carbpol.2014.09.086.

[18] ZHANG H N, MA H L, LIU W, et al. Ultrasound enhanced production and antioxidant activity of polysaccharides from mycelial fermentation of Phellinus igniarius[J]. Carbohydrate Polymers, 2014, 113: 380-387. DOI:10.1016/j.carbpol.2014.07.027.

[19] KARDOS N, LUCHE J L. Sonochemistry of carbohydrate compound[J]. Carbohydrate Research, 2001, 332(2): 115-131. DOI:10.1016/S0008-6215(01)00081-7.

[20] NAIK G H, PRIYADARSINI K I, SATAV J G, et al. Comparative antioxidant activity of individual herbal components used in Ayurvedic medicine[J]. Phytochemistry, 2003, 63(1):97-104. DOI:10.1016/ S0031-9422(02)00754-9.

[21] 李岱, 张静, 孙润广. 超声波处理对柴胡多糖提取率、微观形貌特征及生物活性的影响[J]. 生物加工过程, 2009, 7(2): 29-34. DOI:10.3969/j.issn.1672-3678.2009.02.006.

[22] YANG B, ZHAO M M, SHI J, et al. Effect of ultrasonic treatment on the recovery and DPPH radical scavenging activity of polysaccharides from longan fruit pericarp[J]. Food Chemistry, 2008, 106(2): 685-690. DOI:10.1016/j.foodchem.2007.06.031.

[23] 涂宗财, 寇玉, 王辉, 等. 荷叶多糖的超声波辅助提取和抗氧化活性[J].食品科学, 2013, 34(16): 108-112. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201316022.

[24] 严碧歌, 赵凯, 杜柯. 超声波提取对麦冬多糖结构和抗氧化活性的影响[J]. 压电与声光, 2011, 33(6): 859-862. DOI:10.3969/ j.issn.1004-2474.2011.06.004.

[25] XING R E, LIU S, GUO Z Y, et al. Relevance of molecular weight of chitosan and its derivatives and their antioxidant activities in vitro[J]. Bioorganic and Medicinal Chemistry, 2005, 13(5): 1573-1577. DOI:10.1016/j.bmc.2004.12.022.

Effect of Ultrasonic Treatment on Antioxidant Activity of Polysaccharides from Mature Fruits of Schisandra chinensis

WANG Yanqun, MENG Xianjun
(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

Ultrasonic treatment was employed to improve the antioxidant activity of polysaccharides from the mature fruits of Schisandra chinensis. Based on hydroxyl and DPPH radical scavenging activity, the effects of ultrasonic power and treatment time on antioxidant activity of polysaccharides were studied. The results showed that both ultrasonic power and treatment time had significant effects on the antioxidant activity of polysaccharides. The optimal conditions of ultrasonic treatment were 330 W of ultrasonic power, 20 min of treatment time. Under these conditions, the scavenging rates of hydroxyl and DPPH radicals were increased from 74.34% to 87.05%, and from 84.43% to 95.05%, respectively. The IC50of the treated polysaccharides for scavenging of hydroxyl and DPPH radicals were 10.7 and less than 2 mg/mL, respectively. In conclusion, appropriate ultrasonic treatment can improve the antioxidant activity of polysaccharides from Schisandra chinensis fruits.

Schisandra chinensis; polysaccharides; antioxidant activity; ultrasonic treatment

10.7506/spkx1002-6630-201603013

TS201

A

1002-6630（2016）03-0066-05

汪艳群, 孟宪军. 超声波处理对北五味子多糖抗氧化活性的影响[J]. 食品科学, 2016, 37(3): 66-70. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201603013. http://www.spkx.net.cn

WANG Yanqun, MENG Xianjun. Effect of ultrasonic treatment on antioxidant activity of polysaccharides from mature fruits of Schisandra chinensis[J]. Food Science, 2016, 37(3): 66-70. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603013. http://www.spkx.net.cn

2015-08-24

沈阳农业大学青年教师科研基金项目（20121005）

汪艳群（1980—），女，讲师，博士，研究方向为小浆果加工及植物活性成分。E-mail：syauwyq@163.com