H1和H3亚型猪流感病毒二重TaqMan-MGB探针荧光RT-PCR检测方法的建立

王建华，陈小金，张俊哲，王玉玲，肖　妍，赵　丹，谭旭菲，王乃福，陈本龙，董志珍，赵祥平

（天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，天津　300456）

H1和H3亚型猪流感病毒二重TaqMan-MGB探针荧光RT-PCR检测方法的建立

王建华，陈小金，张俊哲，王玉玲，肖妍，赵丹，谭旭菲，王乃福，陈本龙，董志珍，赵祥平

（天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，天津300456）

根据H1和H3亚型猪流感病毒（SIV）血凝素（HA）编码基因的保守序列，分别设计合成特异性引物和TaqMan-MGB探针，建立了一种检测H1和H3亚型SIV的二重荧光RT-PCR方法。结果显示，该方法仅对H1和H3亚型SIV呈特异性扩增，对H9亚型SIV、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（SFV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）无交叉扩增反应；用该方法检测H1和H3亚型SIV的HA基因的 RNA标准对照（SIV-H1-RNA，SIV-H3-RNA），最适线性检测范围分别为3.7×101～3.7×108拷贝数/反应和3.4×100～3.4×108拷贝数/反应，最低检出限分别为38和34个拷贝数；该方法的组内试验和组间试验的变异系数均小于2.0%，显示其具有良好的可重复性。用该方法对520份进口猪的鼻拭子样本和78份国内猪鼻拭子样本进行SIV检测发现，进口猪鼻拭子样本的SIV检测结果均为阴性，12份国内猪鼻拭子样本的H1亚型SIV检测结果为阳性，5份国内猪鼻拭子样本的H3亚型SIV检测结果为阳性。本方法的建立为H1和H3亚型SIV检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。

猪流感病毒；H1亚型；H3亚型；TaqMan探针；荧光RT-PCR

猪流感（Swine Infl uenza，SI）是由A型猪流感病毒（SIV）引起猪的一种急性、热性、高度接触性和群发性呼吸道疾病，临床上以高热、厌食、咳嗽、呼吸困难和怀孕母猪繁殖障碍为典型表现［1］。SI广泛流行于全球各主要养猪国家和地区。目前我国规模化养猪场的H1N1和H3N2亚型SIV流行和危害比较严重且难以根除［2-4］，需加强对国内猪群SIV的监测、流行病学调查与防控技术研究，以及对国外进口种猪的SIV检疫工作。目前诊断SI的常规方法是采用鸡胚进行病毒分离培养，继而对培养物进行血凝及血凝抑制试验，存在操作繁琐和诊断周期长等不足［5］。近年来实时荧光定量PCR技术以其灵敏度高、特异性强、检测快速等优点已被用于SIV核酸的检测［6-8］。本研究基于H1和H3亚型SIV的HA基因保守序列，建立了一种检测H1和H3亚型SIV的二重荧光RT-PCR检测方法。

1　材料与方法

1.1病毒核酸及临床样本

H1、H3和H9亚型的SIV核酸，猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（SFV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）的核酸，由天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心动物检疫实验室保存。2012—2015年期间保存的520份猪鼻拭子样本（来自美国和丹麦进口猪）和78份国内猪鼻拭子样本（来自国内猪场的疑似病猪）。

1.2主要仪器与试剂

Light Cycler® 480荧光PCR（Rochi）、5417R EPPENDORF冷冻离心机和ESCO CLASS Ⅱ BSC生物安全柜；TRIzol LS Reagent 购自Invetrogent公司；TaKaRa ExTaqRDNA 聚合酶、PstI 限制性内切酶、One Step PrimeScript™ RT-PCR Kit（Perfect Real Time），购自大连宝生物工程（大连）有限公司；质粒快速提取试剂盒，购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司；Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System、RiboMAXTMLarge Scale RNA Production System T7，购自Promega公司。其他试剂均为国内或进口分析纯试剂。

1.3引物及探针的设计与合成

从GenBank数据库（http∶//www.ncbi.nlm.nih. gov/）下载H1和H3亚型SIV的HA基因序列，进行生物学信息分析，选出高度保守且特异的区域，用Beacon Designer 7.0软件设计特异引物和TaqMan-MGB探针，由上海百力格生物技术有限公司合成。针对HA基因的探针序列5´端用FAM标记，3´端用MGB标记；针对H3基因的探针序列5´端用NED标记，3´端用MGB标记；预期扩增片段长度分别为74 bp和87 bp。引物和探针序列见表1 。

表1　用于检测H1和H3亚型SIV的HA基因的引物与探针序列

1.4RNA标准对照制备

根据H1和H3亚型SIV的HA基因序列（KP336278、KM061018 ）各自设计4条寡核酸链，用于RNA标准对照的制备，序列见表2。以SIV-H1-M1/ SIV-H1-M2为模板、SIV-H1-F2/ SIVH1-R2为引物，按常规PCR方法进行扩增；将扩增产物用胶回收试剂盒回收，与PCR2.1克隆载体连接，转化至E.coli DH5α感受态细胞；挑选阳性重组克隆，由上海英骏生物技术有限公司测序鉴定。以经PstⅠ酶切线性化的阳性重组质粒DNA为模板，采用RiboMAX Large Scale RNA Production System-T7试剂盒，按说明书进行体外转录；对获得的体外转录产物进行RQ1 DNA酶消化及纯化后即制备成含有H1亚型SIV HA基因靶序列的RNA标准对照，命名为SIV-H1-RNA。用核酸蛋白分析仪测定NiV-M-RNA的浓度，按公式y（copies/µL）= ［x（g/µL）RNA/（transcript length in nucleotides×340）］×6.02×1023，换算其拷贝数。以SIV-H3-M1/SIV-H3-M2为模板、SIV-H3-F2/SIVH3-R2为引物，按常规PCR方法进行扩增。按同法制备含有H3亚型SIV HA基因靶序列的RNA标准对照，命名为SIV-H3-RNA，并换算其拷贝数。

表2　用于制备RNA标准对照的寡核酸链

1.5总RNA提取

按常规TROZOL试剂方法操作，提取样本的总RNA， 并于-80 ℃保存备用。

1.6二重荧光RT-PCR反应条件的优化

采用 One Step PrimeScript™ RT-PCR Kit（Perfect Real Time）试剂，在Light Cycler® 480荧光PCR（Rochi）仪上，首先确定SIV-H1-RNA（4.6×106copies /µL）和SIV-H3-RNA（4.1×106copies /µL）单一荧光RT-PCR反应的最适引物和探针浓度，然后对25 µL二重荧光RT-PCR反应体系下的混合引物和探针浓度以及56～61 ℃范围内的退火延伸温度做进一步优化试验，以确定最适的反应条件。

1.7标准曲线的绘制

对SIV-H1-RNA和SIV-H3-RNA进行10倍系列稀释，使其浓度范围分别为3.7×101～3.7×107copies/µL和3.4×100～3.4×108copies/µL。在优化的25 µL二重荧光RT-PCR反应条件下，对每个稀释度的SIV-H1-RNA 吸取1 µL为模板进行RT-PCR扩增，反应结束后，以Ct值为横坐标、SIV-H1-RNA模板起始拷贝数浓度的对数为纵坐标，绘制定量标准曲线；按同法绘制SIV-H3-RNA的定量标准曲线。

1.8敏感性试验、重复性试验和特异性试验

对浓度范围为3.7×101～3.7×107copies /µL的SIV-H1-RNA和 3.4×100～3.4×108copies /µL的SIV-H3-RNA，分别吸取1 µL按1.6优化反应条件进行试验，以确定该方法可以检测SIV-H1-RNA和SIV-H3-RNA的最低拷贝数。对3个浓度的SIVH1-RNA 和SIV-H3-RNA 分别取1 µL为模板，分别进行组内试验和组间试验，以确定该方法的重复性。以H1亚型、H3亚型和H9亚型的SIV核酸，以及PRRSV、SFV、PEDV和TGEV的核酸为模板，按1.6优化反应条件进行试验，以确定该方法的特异性。

1.9临床样本检测

对2012—2015年期间保存的598份猪鼻拭子样本，采用本研究建立的二重荧光RT-PCR方法进行H1和H3亚型SIV核酸检测，以评价该方法的实用性。当Ct值小于35时判定为阳性，Ct值在35～40之间的判定为可疑，如重复试验结果的Ct值仍在35～40之间时判定为阴性，无Ct值时判定为阴性。

2　结果

2.1荧光RT-PCR反应条件优化

以SIV-H1-RNA（4.6×106copies /µL）和SIVH3-RNA（4.1×106copies /µL）为模板，通过对不同浓度组合的引物和标记探针以及56～61 ℃范围内退火延伸温度的优化试验，最终确定的二重荧光RT-PCR反应体系为：在25 µL反应体系中，依次加入2×One Step RT-PCR bufferⅢ 12.5 µL，TaKaRa Ex TaqHS （5 U/µL）0.5 µL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ 0.5 µL，SIV-H1-F（10 pmmol/ µL）、SIV-H1-R（10 pmmol/µL）、SIV-H1-P（4 pmmol/µL）SIV-H3-F（10 pmmol/µL）、SIV-H3-R（10 pmmol/µL） 和SIV-H3-P（4 pmmol/µL） 各0.5 µL，模板适量，补足水至25 µL。反应参数为42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 sec，然后95 ℃ 10 sec，60 ℃30 sec，45个循环。在每一次循环的60 ℃延伸扩增，结束前，采集FAM和NED通道的荧光信号。在最适反应条件下，对SIV-H1-RNA和SIV-H3-RNA进行扩增呈现典型的S型荧光定量PCR反应动力学扩增曲线（图1）。

图1　二重荧光RT-PCR动力学曲线

2.2标准曲线的的绘制

对10倍系列稀释的SIV-H1-RNA和SIV-H3-RNA，按优化后的二重荧光RT-PCR反应条件进行检测， 扩增曲线见图2-A和图2-B；以起始模板浓度的对数为X轴，Ct 值为Y轴绘制成的标准曲线见图2-C、图2-D。对SIV-H1-RNA的定量检测的线性范围为3.7×101～3.7×108copies /µL，线性关系表达式为Y= -3.311 4X+32.244，相关系数（R2）为0. 999 4。对SIV-H3-RNA的定量检测的线性范围为3.4×101～3.4×108copies /µL，线性关系表达式为Y= -3.308 2X+36.936，相关系数（R2）为0.999 6。

2.3敏感性试验

对SIV-H1-RNA（3.7×101～3.7×108copies /µL）和SIV-H3-RNA（3.4×101～3.4×108copies /µL），按优化后的二重荧光RT-PCR反应条件进行检测，扩增曲线见图2-A和图2-B。由图2可知，该方法最低可检出37个拷贝的SIV-H1-RNA分子和34个拷贝的SIV-H3-RNA分子。

2.4重复性试验

分别选取3个浓度的SIV-H1-RNA和SIVH3-RNA标准对照为模板，按优化的反应条件进行组内和组间重复试验，每个稀释度的Ct值和标准差（SD）及变异系数（CV）见表3和表4。3个浓度的RNA标准对照的Ct值变异系数均小于2.0%，表明本试验所建立的二重荧光RT-PCR检测体系稳定，具有良好的重复性。

图2　SIV-H1-RNA和SIV-H3-RNA的二重荧光RT-PCR试验的敏感性和标准曲线

表3　SIV-H1-RNA标准对照实时荧光RT-PCR重复性试验结果

表4　SIV-H3-RNA标准对照实时荧光RT-PCR重复性试验结果

2.5特异性试验

应用本试验建立的二重荧光RT-PCR方法，对H1、H3和H9亚型的SIV核酸，以及PRRSV、SFV、PEDV和TGEV的核酸进行检测，结果见图3。由图3可知，仅H1和H3亚型SIV出现典型的扩增曲线，而H9亚型的SIV核酸以及PRSSV、CSFV、PEDV和PGEV均无扩增曲线出现，表明该方法检测H1和H3亚型 SIV核酸有良好的特异性。

2.6临床样本的检测

对2012—2015年保存的520份进口猪的鼻拭子样本（组A）和78份国内猪场猪鼻拭子样本（组B），用本研究建立的二重荧光RT-PCR方法进行H1和H3亚型SIV检测，结果见表5。由表5可知，520份进口猪鼻拭子样本的SIV检测结果均为阴性，在78份采自国内猪场猪鼻拭子样本中，有12份为H1亚型SIV检测结果阳性，有5份为H3亚型SIV检测结果阳性。

图3　二重荧光RT-PCR检测H1、H3亚型SIV的特异性

表5　598份实际样本的H1和H3亚型SIV实时荧光RT-PCR检测结果

3　讨论

近年来，SIV因作为一种猪呼吸道疾病综合症的原发性病原和同时具有感染人和禽的潜力而日益受到重视。一方面SIV对猪呼吸道上皮的防御屏障破坏，极易导致猪发生PRRSV、PCV2、肺炎支原体和胸膜肺炎放线杆菌感染或继发感染，从而延长病程和增高死亡率，对猪群危害极大［9］；另一方面，猪被认为是人、禽和/或猪流感病毒通过基因重排产生新的亚型流感病毒的“混合器”［10］。因此，对猪群SIV感染的监测及分子流行病学分析不仅可为调查猪呼吸道疾病综合症的病因及制定控制措施提供重要的病原学依据，而且在预防和朔源人类流感流行方面具有重要的公共卫生意义。与传统的检测SIV的鸡胚病毒分离方法和血凝抑制试验相比较，应用荧光RT-PCR检测SIV核酸具有快速而敏感的优势。目前国内研究人员已报道了多种检测SIV的荧光RT-PCR［6-8］。根据H1和H3亚型SIV的HA基因保守序列，本研究建立了一种同时检测H1和H3亚型SIV核酸的TaqMan 探针二重荧光RT-PCR检测方法。试验结果表明该方法具有良好的特异性，仅对H1和H3亚型SIV核酸呈特异性扩增，对猪的其他常见病毒无交叉扩增反应，该方法对标准对照SIV-H1-RNA和SIV-H3-RNA最低可分别检出37和34个拷贝数，并显示出良好的定量线性关系和重复性。通过对520份进口猪的鼻拭子样本和78份国内猪场猪鼻拭子样本的实际检测试验，表明本研究建立的二重荧光RT-PCR 检测方法可用于临床样本中H1和H3亚型SIV的检测。

［1］ 杜宁，李德新，舒跃龙，等. 猪流感病原学概述［J］. 病毒学报，2009，25（增刊）：39-47.

［2］ 李海燕，于康震，辛晓光，等. 部分省市猪群猪流感的血清学调查及猪流感病毒的分离与鉴定［J］. 动物医学进展，2003，24（3）：67-72.

［3］ 何淑仪，马骏，方博华，等. 南地区猪场猪流感和甲型H1N1/2009流感病毒的血清学调查［J］. 中国预防兽医学报，2015，37（9）：660-664.

［4］ 徐敏，贾春玲，杨德胜，等. 广东省H1和H3亚型猪流感病毒抗体血清学调查［J］. 动物医学进展，2010，31（10）：116-120.

［5］ 毕保良，李进涛. 猪流感诊断技术研究进展［J］. 中国畜牧兽医，2009，36（10）：179-183.

［6］ 张春明，乔传玲，陈艳，等. 猪流感病毒M基因实时荧光定量PCR诊断方法的建立［J］ .中国预防兽医学报，2008，30（10）：805-809.

［7］ Slomka M J， Densham A L，Coward V J，et al. Real time reverse transcription（RRT）-polymerase chain reaction （PCR）methods for detection of pandemic（H1N1）2009 influenza virus and European swine influenza A virus infections in pigs. Infl uenza Other Respir Viruses［J］. 2010，4（5）：277-293.

［8］ Nagarajan M M，Simard G，Longtin D，et al. Singlestep multiplex conventional and real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays for simultaneous detection and subtype differentiation of Influenza A virus in swine［J］. J Vet Diagn Invest，2010，22（3）：402-408.

［9］ 杨斌. 规模化猪场猪呼吸道综合征的防控措施［J］. 中国猪业，2013（S2）：141-144.

［10］ 朱闻斐，舒跃龙. 人感染猪流感病毒概述［J］. 病毒学报，2013，29（5）：559-565.

Development of a Duplex TaqMan-MGB Real-time RT-PCR Assay for Detecting H1 and H3 Subtype Swine Infl uenza Virus

Wang Jianhua，Chen Xiaojin，Zhang Junzhe，Wang Yuling，Xiao Yan，Zhao Dan，Tan Xufei，Wang Naifu，Chen Benlong，Dong Zhizhen，Zhao Xiaoping
（The Animals and Plants and Food Inspection Center of Tianjin Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300456）

Absract：A Taqman-MGB probe duplex real-time RT-PCR was developed to detect H1 and H3 subtype swine infl uenza virus（SIV）. Two pairs of primers and probes were designed according to the conserved regions of HA gene sequences of H1 and H3 subtype. The assay was specifi c to detect subtype H1 and H3 SIV，but had no cross-reaction with H9N2 subtype SIV，classical swine fever virus（CSFV），porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV），porcine epidemic diarrhea virus （PEDV）and transmissible gastroenteritis virus（TGEV）. The assay has a broad linear detection range from 3.7×101copies/µL to 3.7×108copies/µL for RNA standard control of hemagglutinin（HA）of H1 subtype（SIV-H1-RNA）and 3.4×101copies/µL to 3.4×108copies/µL for RNA standard contol of HA of H3 subtype（SIV-H3-RNA），respectively. The detection limit of the assay was 37 copies for the SIV-H1-RNA and 34 copies for the SIV-H3-RNA，respectively. The coeffi cients of variation（CVs）of both inter-assay and intra-assay were less than 2.0 %，showing good reproducibility. 598 nasal swab samples were tested for subtype H1 and H3 detection by the assay. No positive H1 and H3 subtype reaction was found for all 528 samples from imported pigs. 12 and 7 of 78 nasal swab samples of domestic pigs were found to be positive for H1 and H3 respectively. In short，the development of this assay offers a useful method for the simultaneous detection of subtype H1 and H3 SIV in clinical specimens from the pigs.

swine infl uenza virus；subtype H1；subtype H3；TaqMan probe；duplex real-time RT-PCR

S852.65

B

1005-944X（2016）10-0090-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.10.023

天津市科技支撑项目（13ZCZDNCO1300）；天津市滨海新区惠民项目（2013-BK15H013）

（责任编辑：朱迪国）