热脱硫弧菌解旋酶基因TyPif1的原核表达、纯化及功能分析

王帅锋，刘娜女，段晓磊，罗亦欣，范三红，奚绪光

(西北农林科技大学 生命科学学院，陕西 杨凌 712100)



热脱硫弧菌解旋酶基因TyPif1的原核表达、纯化及功能分析

王帅锋，刘娜女，段晓磊，罗亦欣，范三红，奚绪光

(西北农林科技大学 生命科学学院，陕西 杨凌 712100)

【目的】 通过原核表达系统获得热脱硫弧菌(ThermodesulfovibrioyellowstoniiH.)Pif1解旋酶(TyPif1),研究TyPif1解旋酶的嗜热特性和解旋机理。【方法】 将Typif1解旋酶编码区和SUMO促溶标签编码区融合连入pET15b获得重组表达载体pET15b-SUMO-TyPif1，将该重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3)菌株诱导表达，经Ni-NTA柱亲和纯化获得融合蛋白，SUMO蛋白酶切除标签，再经Ni-NTA柱去除标签蛋白及SUMO蛋白酶，经Heparin柱进一步纯化最终获得TyPif1全长蛋白。通过荧光各向异性、圆二色谱(CD)和荧光共振能量转移(FRET)分析TyPif1解旋酶的DNA结合活性、解旋活性以及二级结构的热稳定性。【结果】 获得了纯度大于95%的TyPif1蛋白，1 L培养基可以获得约10 mg纯度大于95%的蛋白；TyPif1解旋酶结合单链DNA和G4 DNA的活性明显高于双链DNA；TyPif1具有较高的解旋G4 DNA的活性，在25～60 ℃下其二级结构相对稳定，且解旋速率随温度升高而增大，25～50 ℃TyPif1的解旋速率由0.09 s-1增大到0.23 s-1。【结论】 表达纯化了热脱硫弧菌TyPif1解旋酶，其不仅具有良好的热稳定性，同时具有特异的结合和解旋G4 DNA的能力。

热脱硫弧菌；Pif1解旋酶；蛋白表达纯化；DNA结合活性；DNA解旋活性

解旋酶是一类利用水解NTP释放的能量沿着DNA磷酸骨架移动的分子“马达”，参与核酸复制、转录、重组与修复等过程，在生物体内扮演着重要的角色[1-2]。其相关基因突变会导致遗传病的发生，如Werner 综合症、Bloom 综合症等[3-4]。Pif1解旋酶是高度保守的5′→3′方向解旋酶，属于解旋酶超家族Ⅰ的一个亚家族，广泛存在于病毒、原核和真核生物中[5-6]。酿酒酵母(SaccharomycescerevisiaeH.)Pif1是第一个被发现的Pif1基因(ScPif1)，其编码蛋白ScPif1参与线粒体DNA的复制、重组[7-9]；随后的研究表明，ScPif1也参与了端粒长度调控及核内DNA的断裂修复[10-12]，说明ScPif1同时参与了线粒体和核基因组稳定性的维持。酿酒酵母中还存在另一种Pif1-like蛋白Rrm3，其作为复制体的一部分，可以与聚合酶ε的催化亚基Pol2作用并在复制过程中随着复制叉移动[13]；同时，酵母双杂交试验表明，Rrm3 N端保守的motif(模体)可以与PCNA(增殖细胞核抗原)相互作用[14-15]。裂殖酵母(SchizosaccharomycespombeH.)中只存在一个Pif1家族解旋酶基因Pfh1[5]，该基因编码两种形式的Pfh1蛋白，一种定位于线粒体，一种定位于细胞核，缺失线粒体定位Pfh1会引起线粒体DNA丢失，并最终导致细胞死亡；缺失核定位异构体会导致细胞停滞在G2期，并引起核DNA损伤位点的累积[16-17]。哺乳动物中人类和小鼠基因组都只编码单一的Pif1-like蛋白，序列比对发现人类和小鼠Pif1蛋白相似度高达84%，人类Pif1(hPif1)同其他Pif1-like蛋白相似，其作用靶点在细胞核和线粒体[18-19]；而小鼠Pif1可以与端粒酶相互作用，但对端粒长度没有明显影响[5]。

生化研究表明，Pif1解旋酶具有依赖ATP和Mg2+的5′→3′方向的解旋活性，ScPif1和hPif1均可以解旋DNA/DNA、DNA/RNA和G4 DNA底物，且ScPif1解旋DNA/RNA杂合底物的速度要快于DNA/DNA底物[12,20-21]；近期研究发现，ScPif1更偏好解开G4 DNA结构，其解旋G4 DNA的速度高于双链DNA，且G4 DNA的存在能够激活对双链DNA的解旋活力[22]。进化分析发现，原核生物中同样存在Pif1家族解旋酶，它们也具有双链DNA和G4 DNA解旋活力[23]。

获取酶蛋白甚至蛋白/底物共结晶对于阐明特定酶的催化机理具有关键性作用，而嗜热菌蛋白具有易表达纯化、结构稳定、易结晶等优点，通常被用于大分子结构解析，如已报道的DnaB、RecG和XPD等嗜热菌蛋白[24-26]。本研究以一种热脱硫弧菌(ThermodesulfovibrioyellowstoniiH.)(最适生长温度为65 ℃)Pif1基因TyPif1[27]为材料，利用蛋白原核表达系统获得高纯度TyPif1蛋白，并对其热稳定性、DNA结合活性和解螺旋活性进行分析,以期拓展原核生物Pif1家族解旋酶活性研究，并为Pif1家族解旋酶结构解析提供素材。

1　材料与方法

1.1材料

表达载体pET15b、克隆菌株E.coli2984、表达菌株E.coliBL21(DE3)均为本实验室保存；限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ购自NEB公司；T4 DNA连接酶、Prime STAR HS DNA polymerase购自大连宝生物公司；PageRuler预染蛋白Ladder购自Thermo Scientific公司；Ni-NTA Beads购自QIAGEN公司；HiTrap Heparin HP 5 mL预装柱购自GE公司；其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.2方法

1.2.1底物制备用于底物制备的荧光标记和非标记单链DNA由上海生工生物公司合成；制备双链和带有G4结构的DNA底物时，将对应寡核苷酸溶于包含100 mmol/L KCl的Tris-HCl(50 mmol/L，pH 8.0)缓冲液中，100 ℃加热5 min，然后缓慢冷却至室温。DNA底物的序列长度见表1，其中前5种底物用于DNA结合活性测定，第6～8种底物用于DNA解旋活性测定。

表 1　试验所用的DNA底物信息Table 1　DNA oligonucleotides used in the study

注：F代表荧光素；H代表六氯荧光素。

Note:F represents fluorescein;HF represents hexachloro fluorescein.

1.2.2表达载体的构建EcoRⅠ和XhoⅠ酶切pBMH-TyPif1质粒(该质粒中包含TyPif1解旋酶编码序列，由BioMatik公司合成)，获得TyPif1基因编码区序列；对编码序列进行PCR扩增获得SUMO编码序列(本实验室保存)，并用NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切，将获得的2个基因片段与同样经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切的pET15b载体混合连接；经菌落PCR、双酶切检测及测序确证后，最终获得重组表达载体pET15b-SUMO-TyPif1。

1.2.3重组TyPif1解旋酶在大肠杆菌中的过量表达和纯化将重组载体pET15b-SUMO-TyPif1转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单克隆活化，37 ℃扩大培养至OD600为0.6～0.8时加入IPTG(终浓度0.2 mmol/L)，28 ℃诱导培养6～8 h。离心收获菌体并称质量，按照1∶5～1∶10的质量体积比加入lysis Buffer(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，300 mmol/L NaCl，体积分数10% 甘油，10 mmol/L 咪唑)，高压破碎细胞，并进一步超声断裂DNA，以降低溶液黏度，12 000 r/min离心20 min后用0.45 μm滤膜过滤，所得上清载入Ni-NTA亲和柱，使用Elute Buffer(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，300 mmol/L NaCl，体积分数10% 甘油，300 mmol/L 咪唑)洗脱。按照1∶1 000物质的量比加入SUMO蛋白酶，4 ℃过夜酶切，透析除去咪唑后再次载入Ni-NTA亲和柱，收集穿出液；用无盐缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，体积分数10% 甘油)稀释1倍，然后载入Heparin柱进一步纯化。收集目标蛋白组分，使用30 ku的Millipore超滤管离心浓缩，分装后液氮冷冻，-80 ℃保存备用。分离过程中使用10%SDS-PAGE电泳检测各步骤获得样品的纯度。

1.2.4TyPif1解旋酶的DNA结合活性测定用Infinite F200/M200型多功能酶标仪(瑞士Tecan公司)测定TyPif1解旋酶的DNA结合活性，反应体系150 μL，其中包含5 nmol/L荧光标记DNA和TyPif1解旋酶， 37 ℃孵育5 min后测定每一个反应体系的各向异性值。由于盐浓度和pH对解旋酶与DNA结合活性的影响很大，因此首先以18nt ssDNA为参考测定TyPif1结合DNA的最适缓冲液组分(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.5，50 mmol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2，2 mmol/L DTT)。在此条件下分别测定5种底物(表1中1～5底物)的各向异性值，用米氏方程拟合试验结果，Binding size(结合步长)参考Dou等[28]的方法计算。

1.2.5TyPif1解旋酶的热稳定性分析使用Bio-Logic MOS450/AF-CD光学系统(法国Bio-Logic公司)，检测TyPif1在波长190～260 nm下的圆二色光谱(CD)值，以在25 ℃生活的拟杆菌(Bacteroidesspp.)Pif1解旋酶(BsPif1)(本实验室制备，分子质量50 ku)为对照。测定时将Pif1蛋白稀释至0.5 mg/mL，注入厚度为1 mm的石英杯中，在不同温度(25，30，37，45，50，55，60 ℃)下分别进行样品的CD测试，每个温度处理预平衡3 min，检测步长1 nm，分辨率0.1 nm，扫描速度100 nm/min,每试验重复3次。使用公式：θmoral,λ=θλ×100/m×d处理数据，其中，θλ为不同波长下的CD吸收峰(mdeg)，m为样品的物质的量(mol)，d为石英杯的厚度(cm)[29]。

1.2.6TyPif1解旋酶的DNA解旋活性测定使用Bio-Logic SFM-400混合仪(法国Bio-Logic公司)，利用荧光共振能量转移(FRET)原理测定TyPif1解开DNA螺旋的活性，以BsPif1为对照。DNA底物的2条链分别用荧光素和六氯荧光素标记，激发波长492 nm，检测波长525 nm。反应体系缓冲液包含25 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)、10 mmol/L NaCl、5 mmol/L MgCl2、1 mmol/L ATP，解旋酶浓度为100 nmol/L，底物浓度为4 nmol/L。用14nt-38bp底物研究温度对Pif1蛋白解旋活性的影响，温度设置为25，30，37，45，50，55 ℃；50nt-16bp和26nt-3G4-17bp底物用于TyPif1的解旋底物偏好性测定，解旋试验数据处理参考Zhang等[30]的方法。

2　结果与分析

2.1TyPif1基因表达载体构建及编码蛋白的表达纯化

构建表达载体pET15b-SUMO-TyPif1的流程见图1-A，该载体经EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切检测获得预期条带(图1-B)。将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)表达菌，28 ℃诱导表达后重组蛋白大部分以可溶形式存在(图1-C泳道2)。上清经过Ni-NTA亲和柱纯化、SUMO蛋白酶切并再次过Ni-NTA亲和柱及Heparin柱，纯化后再用10%SDS-PAGE电泳检测(图1-C)。最终在1 L 发酵LB培养基中获得了约10 mg纯度大于95%的蛋白。

图 1pET15b-SUMO-TyPif1载体构建(A)、双酶切检测(B)及TyPif1蛋白的表达纯化(C)

(B)M.DS5000 DNA Marker,1.EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切的pET15b-SUMO-TyPif1载体；(C)M.蛋白Marker,1.不溶蛋白,2.可溶蛋白,3.Ni-NTA磁珠纯化的重组蛋白,4.SUMO酶切的重组蛋白,5.再次被Ni-NTA磁珠纯化的TyPif1蛋白,6.被Heparin柱纯化的TyPif1蛋白,7.纯化后的TyPif1蛋白

Fig.1Construction and double digestion of recombination vector(A),expression (B) and purification (C)of TyPif1 helicase analyzed by SDS-PAGE

(B)M.DS5000 DNA Marker,1.pET15b-SUMO-TyPif1 digested withEcoRⅠ andXhoⅠ;(C)M.Protein Marker,1.Insoluble protein induced by IPTG,2.Soluble protein induced by IPTG,3.Recombinant protein purified by Ni-NTA beads,4.Recombinant protein cleaved by SUMO protease,5.TyPif1 re-purified by Ni-NTA beads,6.TyPif1 purified by Heparin column,7.TyPif1 after final concentration

2.2TyPif1解旋酶的DNA结合活性

酶标仪试验结果表明，TyPif1解旋酶结合单链、双链以及G4螺旋DNA底物的活力具有差异性，依据米氏方程拟合，得到TyPif1结合24nt ssDNA、G4 DNA、24bp dsDNA的米氏常数Km依次为14.03±1.69，13.97±2.92，223.79±54.61，由Km值可知，解旋酶对不同底物的结合活性强弱依次为G4 DNA>24nt ssDNA≫24bp dsDNA(图2-A)。TyPif1解旋酶结合16、18、24 nt ssDNA的各向异性值经过数据处理后结果如图2-B所示。由图2-B可见，随着DNA长度的延长，结合相同总量的底物所需要的解旋酶增多，表明DNA底物越长需要结合解旋酶的分子数量越多。数据处理后得到TyPif1结合单链DNA的化学计量数(N)与单链长度的线性关系，当化学计量数N=1时，表明在底物上只结合1个解旋酶分子，根据线性关系得出底物长度为11.27 nt，即Binding size=11.27 nt(图2-C)。

图 2TyPif1解旋酶的DNA结合活性

(A)TyPif1解旋酶结合单链DNA、双链DNA和G4 DNA的比较；(B)TyPif1解旋酶结合不同单链DNA底物的比较；(C)单链DNA底物与化学计量数的线性关系

Fig.2DNA binding activity of TyPif1

(A)Comparison of binding to ssDNA,dsDNA and G4 DNA to TyPif1 helicase;(B)Comparison of TyPif1 helicase binding to different length ssDNA helicase;(C)The linear relationship of ssDNA substrate and number of stoichiometry

2.3TyPif1解旋酶的热稳定性

由图3-A可知，TyPif1在216 nm处有一个强负峰，且随着温度升高其负峰强度逐渐减小，表明其二级结构以β折叠为主，且随温度升高β折叠含量逐渐减少；但是TyPif1随温度改变呈现相似的CD曲线，说明其二级结构在25～60 ℃变化不大。而BsPif1的CD图谱随着温度升高负峰强度减小且温度高于45 ℃后出现峰迁移现象(图3-B)，由此可知BsPif1在温度高于45 ℃后二级结构发生剧烈变化。

图 3不同温度下TyPif1(A)和BsPif1(B)二级结构的CD谱图

Fig.3CD spectra of TyPif1(A) and BsPif1(B) at different temperatures

2.4TyPif1解旋酶的解旋活性

使用FRET方法检测TyPif1解旋的DNA底物，结果如图4所示。由图4-A可知，嗜热菌TyPif1的解旋速率低于BsPif1，然而温度升高时TyPif1解旋DNA双链的速率由25 ℃时的0.09 s-1增加到50 ℃时的0.23 s-1，而BsPif1的解旋速率则随着温度升高而降低，高于45 ℃解旋活性完全丧失。这表明温度对TyPif1解旋酶具有激活作用，温度升高有利于解旋反应的进行，这与该嗜热细菌生活环境中的生长和代谢规律相吻合。图4-B反映了TyPif1解旋G4 DNA和双链DNA的差异，数据经双指数拟合得到TyPif1解开G4 DNA和双链DNA的速率分别为0.546和0.301 s-1，表明TyPif1解旋G4 DNA的活力明显高于双链DNA。

图 4　TyPif1酶在不同温度(A)和DNA底物(B)下的解旋活性

3　讨　论

本研究利用原核系统表达纯化了一种热脱硫弧菌Pif1解旋酶，利用优化的纯化方法可从1 L菌液中得到约10 mg纯度大于95%的全长TyPif1蛋白。试验测定了TyPif1解旋酶与不同DNA底物的结合活性，发现其结合G4 DNA和单链DNA的活性要高于双链DNA，TyPif1对G4 DNA的高亲和力是其特异性解旋G4 DNA的保证。Dou等[28]研究大肠杆菌RecQ解旋酶的DNA结合特性时，得到大肠杆菌RecQ解旋酶的Binding size为8～12 nt。本研究通过对不同长度单链DNA结合活性的测定，得出TyPif1结合DNA底物的Binding size为11.27 nt，但是由于使用单链较少，获得的Binding size可能会有所偏差。

Paeschke等[23]研究表明，Pif1解旋酶解旋G4 DNA的活力是RecQ家族解旋酶的1 000倍，此外，通过对比不同的解旋底物发现，RecQ家族解旋酶擅长解旋Y-结构底物，而Pif1家族擅长解旋G4 DNA底物。最新研究表明，ScPif1解旋酶以单体形式发挥作用，同时研究还证明，G4结构的存在能够强烈激活ScPif1解旋酶的解旋双链DNA底物活力[22]。本研究发现，TyPif1解旋酶同样能解旋双链DNA和G4 DNA，且解旋G4 DNA的速率高于双链DNA，表明其更偏好于解旋含有G4结构的DNA底物，这与最近报道的ScPif1解旋酶的特性一致，然而ScPif1解旋酶解旋G4 DNA底物的速度高于TyPif1解旋酶[22-23]。

TyPif1解旋酶基因来自于一种生活在黄石湖热水口的热脱硫弧菌[27]，本研究通过圆二色谱(CD)分析发现，TyPif1解旋酶在25～60 ℃内二级结构稳定，其DNA解螺旋活性随着温度升高而增大；而在25 ℃环境中生活的拟杆菌BsPif1解旋酶活力随着温度升高逐渐丧失。TyPif1的这一现象与其在生活环境中的生长和代谢规律吻合，而有关真核生物Pif1解旋酶如ScPif1和hPif1却无此报道。

Pif1解旋酶家族其他成员如hPif1、Rrm3、Pfh1不能获得全长蛋白[23]，而TyPif1解旋酶具有该家族成员共有的DNA结合特性和解旋活性，同时具有良好的热稳定性。选择热脱硫弧菌Pif1解旋酶作为研究材料，一方面可拓展Pif1解旋酶的研究范围，另一方面则是由于嗜热菌蛋白相对容易结晶。本研究建立的表达纯化体系为后续功能和结构研究提供了一个理想的素材，为基于Pif1解旋酶的新药开发提供了理论依据。

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Prokaryotic expression,purification and functional analysis ofThermodesulfovibrioyellowstoniiH.TyPif1

WANG Shuaifeng,LIU Nanü,DUAN Xiaolei,LUO Yixin,FAN Sanhong,XI Xuguang

(CollegeofLifeScience,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This research used prokaryotic expression system to obtain Pif1 helicase fromThermodesulfovibrioyellowstoniiH.(TyPif1),and studied the mechanism of thermophilic characteristic and unwinding mechanism of TyPif1 helicase.【Method】 ThePif1 gene ofThermodesulfovibrioyellowstoniiH.(Typif1) and a SUMO protein folding tag gene were synthesized to pET15b to construct recombinant plasmid pET15b-SUMO-TyPif1.Then,the plasmid was transformed intoEscherichiacolihost strain BL21 (DE3),and the TyPif1 helicase was purified by two-step Ni-NTA affinity chromatography and one-step Heparin chromatography at 4 ℃ using FPLC.Fluorescence anisotropy,fluorescence resonance energy transfer (FRET) and circular dichroism spectrum (CD) were used to analyze the DNA binding and unwinding activity of TyPif1 as well as the stability of its secondary structure.【Result】 The full-length TyPif1 helicase with high purity of >95% was obtained.Its binding activity with ssDNA and G-quadruplex (G4) DNA was much higher than that of dsDNA.TyPif1 has high activity to unwound G4 DNA.The secondary structure was relatively stable under 25-60 ℃,and the unwinding rate increased from 0.09 s-1to 0.23 s-1with the increase of temperature from 25 to 50 ℃.【Conclusion】 TyPif1 helicase was expressed and purified.TyPif1 helicase not only had good thermal stability,but also had specific ability of binding and unwinding G4 DNA.

ThermodesulfovibrioyellowstoniiH.;Pif1 helicase;protein expression and purification;DNA binding activity;DNA unwinding activity

时间:2016-08-0909:41DOI：10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.09.028

2015-03-06

国家自然科学基金项目(31370798,11304252)

王帅锋(1989-)，男，河南平顶山人，在读硕士，主要从事生物大分子结构与功能研究。E-mail:phoonwang@163.com

奚绪光(1958-)，男，吉林公主岭人，教授，博士，博士生导师，主要从事生物大分子结构及功能研究。

E-mail：xxi01@ens-cachan.fr

Q781；Q814.1

A

1671-9387(2016)09-0207-07

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160809.0941.056.html