子痫前期患者胎盘、胎膜组织中水通道蛋白9的表达变化

白伶俐 芦笛 高霞

【摘要】目的：观察水通道蛋白9（AQP9）在子痫前期患者胎盘、胎膜组织中的定位、mRNA及表达变化，分析AQP9在子痫前期发病中发挥的作用。方法：选取本院2014年3月至2015年5月收治的100例孕妇作为研究对象，其中有50例为正常晚期妊娠孕妇，将这50例作为对照组；另外50例为子痫前期孕妇（孕周38～42周），轻度子痫前期孕妇与重度子痫前期孕妇各25例，将这50例子痫前期患者作为观察组。利用免疫组织化学增强聚合物法对AQP9的定位情况进行测定；利用逆转录-聚合酶链反应对AQP9 mRNA进行检测；利用蛋白印迹技术对蛋白的表达水平进行检测；通过使用凝胶蛋白定量分析软件对蛋白灰度值进行测定。结果：（1）AQP9在羊膜上皮细胞、绒毛膜滋养细胞和合体滋养细胞上定位；（2）两组患者的胎膜组织和胎盘中都有AQP9 mRNA表达；（3）观察组胎膜组织、胎膜中AQP9的灰度值都要高于对照组，差异显著，具有统计学意义（P<0.05），而且观察组中重度子痫前期患者胎膜组织、胎膜中AQP9的灰度值要高于轻度子痫前期患者，对比差异，具有统计学意义（P<0.05）。结论：子痫前期患者AQP9的表达水平得到较大程度的提升，AQP9是造成子痫前期发病的主要因素。

【关键词】子痫前期；胎盘；胎膜组织；AQP9；表达变化

Expression of aquaporin-9 in placenta and fetal membrane of preeclampsia patientsBAI Lingli， LU Di， GAO Xia. Department of Obstetrics， Hospital Affiliated to Yanan University， Yanan 716000， Shaanxi， China

【Abstract】Objectives： To observe changes in the location， mRNA and expression of aquaporin-9 （AQP9） in placenta and fetal membrane of preeclampsia patients， to analyze its role in the pathogenesis of preeclampsia. Methods： 100 pregnant women treated in our hospital from March 2014 to May 2015 were selected including 50 normal third trimester pregnant women as control group and 50 preeclampsia patients （gestational age of 38 to 42 weeks） as observation group， i.e. 25 mild preeclampsia pregnant women and 25 severe ones. Immunohistochemical reinforced polymer was used to determine the location of AQP9， reverse transcription-polymerase chain reaction to test the 9 mRNA， protein imprinting technology to test the protein expression levels， and the gel protein quantitative analysis software for determination of protein grey value. Results： Firstly， the AQP9 was located in amniotic epithelial cells， human chorionic trophocyte and sertoli cells. Secondly， expression of AQP9 was found in the membranes and placenta of both groups. Thirdly， the AQP9 grey value on placenta and fetal membrane in the observation group was higher than the control group， with statistically significant difference （P<0.05）， and the AQP9 grey value on placenta and fetal membrane in patients with severe preeclampsia was also higher than those with mild preeclampsia， with statistically significant difference （P<0.05）. Conclusions： Expression level of AQP9 in patients with preeclampsia increases， indicating AQP9 is the main factor of preeclampsia.

【Key words】Preeclampsia； Placenta； Foetal sac； Aquaporin-9 （AQP9）； Changes in expression

【中图分类号】R714.4【文献标志码】A

孕妇在妊娠期间普遍会患上妊娠期高血压疾病，而子痫前期是最常见的类型之一，同时也是造成孕产妇死亡的主要原因[1]。目前，子痫前期发病机制仍然处于不清晰的状态，专家认为早期形成胎盘时，滋养细胞没有深入入侵子宫内膜，重铸子宫螺旋小动脉出现障碍，从而使胎盘出现“浅着床”现象，这些因素促使子痫前期的发作[2]。细胞分化及迁移过程中，水通道蛋白9（AQP9）会对其产生一定的影响，其表达升高在一定程度上加快了细胞凋亡的速度，细胞的迁移能力逐渐下降，细胞分化和细胞融合也会受到相应抑制作用，导致胎盘出现缺血缺氧现象，由此推断子痫前期发病很有可能与AQP9异常表达有一定的关系。选取2014年3月至2015年5月收治的100例孕产妇，作为子痫前期患者胎盘、胎膜组织中AQP9的表达变化与子痫前期发病的关系的研究对象，其结果如下。

1资料与方法

1.1临床资料

选取都是我院2014年3月至2015年5月收治的剖宫产患者，纳入标准：（1）所有入选患者经B型超声检查均符合子痫前期的诊断标准[3]；（2）患者签订知情同意书。排除标准：（1）患有心、脑、肾、肝等严重性疾病患者；（2）患者为过敏体质，对药物过敏；（3）患者患有精神类疾病或正在参加其他临床试验；（4）未按医嘱用药，导致影响最终疗效判断的患者。将其分为对照组和观察组，各50例。患者年龄为21～36岁，平均年龄为（24.53±4.34）岁，孕周为38～42周。其中50例正常足月妊娠产妇为对照组，25例轻度子痫前期孕妇和25例重度子痫前期产妇为观察组。两组产妇在年龄、孕周等方面比较，差异无统计学意义（P>0.05）。子痫前期发病的诊断标准参考《妇产科学》中相关内容。两组患者都没有患上糖尿病、肾炎、肝炎等合并症，而且两组病人也没有出现妊娠期糖尿病、羊水量异常以及胎膜早破等并发症。对照组患者由于瘢痕子宫、胎位不正等各种因素需要实施剖宫产术，观察组患者除了子痫前期外，没有产生其它并发症，因瘢痕子宫、胎位不正或者病情需要实施剖宫产手术。

1.2方法

1.2.1采集标本对两组患者均实施剖宫产手术，胎盘娩出之后，医师立即在中央无钙化区域取出半径为1.5cm及体积为8cm3的胎盘组织各3份，将取出物置于常温0.9%氯化钠液体中，将血液清洗干净后，将其分成3份，将其中的1份放入标本袋中，并在标本袋中加入10%中性福尔马林，固定1d之后将其送入病理科，经24h石蜡包埋的碳膜组织及胎盘，主要是用作免疫组化研究。将剩下的2份放入冻存管中，对冻存管进行编号，然后将冻存管放入液氮中进行冷却，最后将其保存在-80℃的低温冰箱中，可在Western-blothing实验和RT-PCR实验中使用[3]。

1.2.2免疫组织化学增强聚合物法用石蜡包埋固定的胎膜组织和胎盘，对其进行切片处理，厚度为3μm，将其进行脱蜡复水处理之后，放入EDTA中，让其进行修复。在浓度为30%的过氧化氢溶液中添加甲醇，直至将其稀释成浓度为0.9%的溶液，将胎膜组织和胎盘放入稀释后的溶液10min，这样就能将内源性过氧化物酶清除干净；然后将其封闭在5%BSA中，时间维持15min；再向其中加入经稀释液处理过的一抗（稀释比例为1：2000），并且保持4℃的温度，放置1晚；二抗用过氧化物酶进行标记，羊抗兔比例为1∶100，在室温下孵育时长为40min，用二氨基联苯胺对其进行显色，用苏木素复染[4]。将肝脏细胞当作阳性对照，若细胞膜或细胞质上能清晰地见到棕黄色或者黄色颗粒，则该细胞即为阳性细胞。

1.2.3逆转录-聚合酶链反应利用TRIzol将胎膜组织和胎盘中所有的RNA抽提出来，用分光光度计对260nm和280nm两处位置的吸光度值进行测定，将总RNA的纯度和浓度计算出来，需要注意的是OD260与OD280的比值必须大于1.8，将5lRNA逆转录成cDNA[5]。

1.2.4Western-blothing实验剪碎组织，严格遵照相关文献标准进行，在一抗中应用两组患者胎膜组织和胎盘AQP9多克隆抗体，其比例为1：500，在二抗中采用经过氧化物酶标记处理的羊抗兔IgG，其比例为1：5000[6]。应用凝胶灰度分析软件Quantitry One4.6.2来检测底片，测量其灰度值，同时对AQP9标本和β-actin的灰度值进行检测，AQP9的相对含量就是AQP9灰度值与β-actin灰度值的比值。

1.3统计学的方法

汇总处理两组患者的临床数据后，应用统计学软件SPSS16.0对其进行处理，其中用χ2来检验组间率对比，用率（%）来表示计数资料；若P>0.05，那么差异不具备统计学意义。

2结果

2.1两组产妇胎膜组织和胎盘中AQP9定位情况

对照组和观察组产妇的胎膜组织及胎盘中都能见到AQP9阳性表达细胞，具体定位于绒毛膜滋养细胞、羊膜上皮细胞以及胎盘合体滋养细胞。见图1、图2。

2.2两组产妇胎膜组织和胎盘中AQP9mRNA定性表达

在对照组和观察组产妇的胎膜组织和胎盘中都检测到了AQP9 mRNA表达，两组患者的胎膜组织和胎盘标本中都扩增出β-actin，实际扩增片段是77bp，而且都能够测出AQP9 mRNA表达，其中AQP9扩增的片段是78bp，和预期的长度一致。

2.3两组产妇胎膜组织和胎盘AQP9水平

2.3.1两组产妇胎膜组织和胎盘AQP9表达情况AQP9分子量约为27kda，β-actin分子量大约是43kda。在对照组和观察组产妇胎膜组织及胎盘中都检测到了AQP9。见图3。

图1AQP9在胎膜组织中的表达图2AQP9在胎盘中的表达 图3AQP9在胎膜组织和胎盘中的表达结果2.3.2两组产妇AQP9的灰度值对照组产妇胎膜组织、胎盘中AQP9的灰度值分别为（0.17±0.02）、（0.20±0.02），观察组产妇胎膜组织、胎盘中AQP9的灰度值分别为（0.54±0.16）、（0.54±0.14）。对比差异具有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.3.3观察组中轻度子痫前期与重度子痫前期患者胎膜组织和胎盘AQP9的灰度值25例轻度子痫前期患者胎膜组织和胎盘中的蛋白灰度值分别为（0.39±0.17）、（0.42±0.02），25例重度子痫前期患者胎膜组织和胎盘中的蛋白灰度值分别为（0.68±0.02）、（0.67±0.03），对比差异具有统计学意义（P<0.05）。见表2。

3讨论

3.1AQP9结构、生物学特性及能量代谢

AQP9是一种跨膜糖蛋白，是组成水通道蛋白的重要部分，其cDNA中中共包括2890个核苷酸分子，5个内含子和6个外显子共同组成了AQP9基因，该蛋白一级结构是由跨膜6次的单肽链组成，同源四聚体构成了其高级结构。AQP9对水通透性较好，而且其还能够通透各种小分子，具体包括甘油、尿素、嘧啶和嘌呤，尤其甘油作用较为突出。AQP9是肝脏特异性蛋白，能够在人体内运输甘油。Yoshiki等[5]对爪蟾卵母细胞表达进行研究后，了解到当温度保持在25℃时，AQP9摄取的甘油会达到饱和状态，而且其会随温度的变化而发生改变，当温度在4～25℃范围内时，AQP9摄取的甘油量就会降低70%。Yamamoton[6]的研究结果表明，AQP9的表达水平会严重受到血胰岛素浓度的影响，AQP9表达水平在糖尿病患者中会增加，认为AQP9与脑能量代谢有着密切的联系。

3.2AQP9与子痫前期

3.2.1子痫前期发病与滋养细胞的关系子痫是威胁孕产妇健康甚至生命的四大疾病之一，一般发生在妊娠晚期或产后不久，发生在产前最为常见，被称为产前子痫。子宫螺旋动脉重塑出现障碍与滋养细胞浸润不足有着较大的联系，其是子痫前期发病的主要因素。Arima等[7]通过研究发现，正常足月妊娠产妇合体滋养细胞的凋亡率明显要低于足月妊娠重度子痫前期患者，子痫前期患者由于胎盘滋养细胞的侵袭能力不足，导致绒毛缺氧，与妊娠期高血压疾病关系密切。在本研究中，最终结果表明AQP9在绒毛膜滋养细胞和合体滋养细胞中均有表达，且表达程度在子痫前期患者胎盘、胎膜组织中增强，说明AQP9可能与子痫前期发病存在一定的关系。

3.2.2AQP9与子痫前期的关系全部凋亡细胞在最初会发生形态学改变，造成水大量确实，继发性细胞体积不断缩小，此过程被专家称为凋亡体积缩小。

在AVD时期，AQP9在水穿细胞膜运动中起着至关重要作用。正常孕妇胎盘绒毛滋养细胞总的凋亡率显著低于子痫前期孕妇。在该研究中，AQP9在子痫前期产妇胎膜组织和胎盘中的表达显著高于对照组产妇，在观察组患者中轻度子痫前期产妇要低于重度子痫前期产妇，而AQP9参与滋养细胞凋亡，这表明AQP9很有可能会加剧滋养细胞的凋亡，使胎盘出现缺氧缺血现象。

Wang等[8]通过体外培养试验，发现水通道蛋白促进了水分子渗透细胞运动，其在细胞迁移中发挥着重要的作用。Carbrey等[9]的实验结果显示，滋养细胞与破骨细胞有着相似的分化过程，即能够形成多核结构，具体是分裂活跃而没有分化的细胞滋养细胞，经过融合与分化之后产生的。Fujita等[10，11]发现，AQP9会对破骨细胞分化产生一定的影响，而单核细胞经过融合之后形成了破骨细胞，认为AQP9参与了滋养细胞的分化过程。

Joblonski等[12]通过试验，发现AQP9在正常妊娠病人胎盘组织中的表达较子痫前期患者明显降低，认为AQP9的异常表达对滋养细胞分化、迁移和凋亡产生了巨大的影响，其参与了子痫前期发病过程[13]。本研究表明，观察组胎膜组织、胎盘的AQP9表达明显要高于对照组患者，轻度子痫前期患者要低于重度患者，此结果与Badaut[14]相关研究具有一致性，表明AQP9增强是导致子痫前期发病的主要原因。

参考文献

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