胰腺癌中miRNAs、mRNAs基因表达谱分析

白雪峰，刘跃娟，齐 靖，张 建

（哈尔滨医科大学大庆校区医学信息学院，黑龙江大庆，163319）

胰腺癌中miRNAs、mRNAs基因表达谱分析

白雪峰，刘跃娟，齐 靖，张 建

（哈尔滨医科大学大庆校区医学信息学院，黑龙江大庆，163319）

本文研究miRNAs、mRNAs在胰腺癌中的调控机制。通过对胰腺癌表达谱进行分析，基于生物信息学方法，建立miRNAs-mRNAs网络，通过模块挖掘获得5个功能显著性模块，网络中结点度较大的HUB节点miRNAs，这些结点与胰腺癌的发生、发展密切相关。对每个模块进行聚类分析，得到度数小却聚集的集合，这些基因也和胰腺癌密切相关。对这些模块进行功能注释，多个模块注释到代谢相关的功能上，表明胰腺癌与代谢密切相关；另外，多个模块中具有多个相同功能注释，多个调控相反的功能在同一模块当中出现。这表明在组织自身原来就存在着平衡调控机制。通过本文的研究得到miRNAs与mRNAs协同作用的一些结果，为今后更深入的研究胰腺癌提供指导和借鉴。

胰腺癌；miRNAs；mRNAs；协同

0 引言

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）因其起病隐匿、早期诊断难、手术切除困难、放化疗不敏感以及预后差、死亡率高等原因，成为危害最大的恶性肿瘤之一，其中90%以上为胰腺导管腺癌。因此，深入了解胰腺癌发生发展的分子机制，发现新的潜在治疗靶点尤为重要［1-2］。

近几年的研究表明，miRNA的表达水平与人类重大疾病如癌症等密切相关。这使得miRNA可以作为新的生物标志物用于癌症等重大疾病的早期诊断并可作为新的基因药物作用靶点。

最近，研究发现miRNA在胰腺癌中存在多个异常表达，有的是在胰腺癌癌前病变中研究中发现的［7-8］；有的是在胰腺癌组织标本中研究发现的；还有的是在胰腺癌病人血清中研究中发现的［9-10］。因此研究者认为这些差异表达的miRNA或许会为研究胰腺癌提供新的线索。

目前，虽然识别出一些与胰腺癌发生发展关系密切的miRNAs和mRNAs，但大部分miRNAs和mRNAs在胰腺癌中的作用还是未知的。本研究从miRNA、mRNA表达谱数据，构建胰腺癌疾病网络，进行失调网络的模块挖掘，初步探索其作用机制，为揭示胰腺癌发生发展过程中miRNA与mRNAs的关系和调控作用机制提供新的线索，为胰腺癌的生物治疗提供理论依据。

1 miRNA与动脉粥样硬化

1.1 数据准备

从 NCBI上下载mRNA芯片数据（GSE43795）和miRNA芯片数据（GSE43796），两种芯片包括相同的11病人样本（5 normal/6 PCA），数据处理得到30500个mRNA和1205miRNA。差异基因的选取通过SAM算法获得，通过R代码进行数据处理，选取差异表达的mRNA和miRNA（q-value>0.001和q-value>0.05），得到1585mRNAs和106个miRNAs，这些差异表达的mRNAs和miRNAs作为胰腺癌的潜在致病因素。miRNAs与mRNA的互作对从HMDD数据库下载，与疾病相关的miRNAs为117，与胰腺癌miRNA芯片取交集共有miRNAs92个，这些数据将用做以后分析使用。对获得的疾病表达谱数据为获得更多关于胰腺癌生物学信息，通过以下步骤行处理（图1）。利用差异表达的mRNAs和在HMDD数据库miRNA调控的mRNAs映射到KEGG通路当中，通过Subpathway-GM进行子通路挖掘，最终形成mRNAs-miRNAs互作网络。用Cytoscape插件对网络进行功能模块挖掘，获得5个功能显著性模块，最后通过David进行基因的功能注释。

1.2 表达谱网络分析

利用Subpathwaymine 进行子通路重构，合并子通路形成miRNA-mRNA互作网络，结点数731个，其中包括mRNAs和mRNAs（91/640），3030条边。点表示基因，边表示两个基因间的联系，在网络中，度越大的基因连接的边越多，表明在网络中可能起到HUB结点的作用。另外，还有一些结点虽然度小，但在结点间传输起到重要作用的桥梁作用，这些结点的关系，可能作为PCA中的潜在的致病基因。

图1 数据分析流程图

1.3 网络模块挖掘

利用Cytoscape中的JActivemodule插件进行模块挖掘。获得5个功能性显著模块（module1～module5）。用ClusterOne进行对模块进行聚类，寻找显著性miRNA-mRNA互作对（p-value<0.05）。

1.4 Gene ontology（GO）分析

通过David在线平台完成对模块中重要结点进行功能分析，筛选出具有诊断意义的显示miRNA-mRNA关系对。

miRNAs在许多疾病的发生与发展中扮演了重要的角色，有研究证明，在疾病中miRNAs对mRNAs的调控行使着重要的生物学功能。通过以上步骤进一步对胰腺癌中miRNAs对mRNAs的调控关系做出探索。

2 结果

2.1 差异表达miRNAs、mRNAs

对PCA表达谱数据进行处理，得到差异表达的mRNAs、miRNAs数量分别为1585、106个。取表达谱差异的mRNAs、miRNAs前5%做热图，结果如图2所示。在miRNAs表达谱的热图中，module1中显著表达的有mir-320c；module2包括:mir-222、mir-92b、mir-320c；moudule3则有mir-320c、mir-320b、mir-654、mir-92a、mir-92b；module4含有mir-222、mir-320c、mir-92b；module5未出现上述热图中的miRNAs。通过比较可知，表达谱中mir-222在两个模块中出现，mir-92b在三个模块中出现，而mir-320c在module1～module4模块中全部出现。研究表明［11］mir-222通过靶向p57控制癌细胞的增殖。而mir-92b在胰腺癌的研究中未有文献报道，mir-92b在膀胱癌中仅对癌细胞转移和浸袭起作用，却不会促使细胞的增殖［12］。miR-222可能通过MAPK信号转导通路参与胰腺癌细胞侵袭转移的调控［13］。文献［14］报道mir-320c可能是通过另外一种模式lncRNA-mi RNA-mRNA进行调控。

图2 mRNAs和miRNAs表达谱热图

在mRNAs表达谱的热图中，module2中显著表达的有YWHAH；module3中含有GLS2、YWHAH；module4含有IFNA16；module5出现热图中ACADL、YWHAH。通过比较可知，表达谱中YWHAH在moudule2、moudule3、moudule5中出现。 促血管形成Gremlin 1 通过绑定YWHAH可能发挥着致癌作用，这一结果在宫颈癌肺癌、卵巢、肾、乳腺癌、结肠、胰腺癌中得到证实，Gremlin 1结合目标蛋白YWHAH可能为人类癌症的提供新的诊断和治疗方案［15］。ACADL显著表达与胰腺固状瘤有关［16］。而GLS2蛋白质对肿瘤的生长有抑制作用［17］。

2.2 miRNAs-mRNAs网络模块

癌症属于复杂疾病，对建立的疾病网络已经证明显现幂律分布［18］，从网络分析来看，网络中结点度越大的点，表明可能会影响更多的邻居结点，因此，这些点被考虑扮演hubs结点的角色。图3显示miRNAs-mRNAs网络结点的度分布是幂律分布。通过模块挖掘来研究miRNAs、mRNAs在癌症当中的共调控方式、以及基于局部策略来分析miRNAs的在胰腺癌中的功能。

图3 网络度分布

根据得到的5个功能模块当中（图4），大部分miRNAs具有较大的度（表1），如:mir-615、mir-222、mir-93-5p、mir-415-3p、mir-877等。在各个模块中有些结点的度较大，mir-93-5p在5个模块中度分别为:19、19、23、26、20；mir-222在模块二、四、五的度数为:15、12、15；mir-24在模块二、三、四、五分别为:18、19、18、13；mir-98在模块四、五都为45。mir-615-3p在模块一、二结点度为61、和65。有意思的是，研究证明hsa-miR-615-5p其异常表达可能与胰腺癌的发生、发展、浸润、转移有关，mir-615-5p对胰腺癌有抑制作用［19］，而在前面表达谱数据中mir-615-5p是下调的，mir-615-3p是上调的；mir-615-5p、mir-615-3p分别通过不同的方式来调节mRNAs表达。

表1 模块中的边和点

在五个模块中，对模块进一步分析，通过clusterone插件对模块进行挖掘，通过挖掘每个模块中重要节点用红色标出，这表明除了度大的点起到了HUB结点的作用，在网络中还有一些结点度虽然小，在局部联系较为紧密，成为一个团队发挥着作用，这些合作的结点可能在疾病发生过程中起到作用。在模块一中RPL32、mir-186-5p、RPL27、RPL29、mir-652-3p聚在一个集合中，在这个小集合中，在狗身上检测到RPL32在各组织上表达都是稳定的［20］，在胰腺癌中mir-186 -5p影响细胞增殖和转移［21］，mir-652与ZEB1结合抑制胰腺癌肿瘤细胞上皮间质（EMT）的酸性微环境，酸性/ mir-655/ZEB1/EMT可能是肿瘤发生的新机制［22］。模块二中YWHAH、FOXO3、CDC25C、YWHAB、YWHAZ构成的集合中，YWHAH、FOXO3、CDC25C与胰腺癌密切相关［15］［23］［24］。从模块二中还可以看到YWHAH和mir-186直接相连，FOXO3和mir-615-3p直接相连，mir-615-3p在模块中起到了HUB结点的作用。另外mir-744、RAN、EIF4G1作为一组联系紧密的集合被发现，miR-744 发现成为新的预后标记物［25］，而RAN通过AR和CXCR4调控胰腺癌的侵袭和转移［26］。RAN也与mir-615-3p直接相连。模块三中mir-10a、mir-320c、LDHA、MT-CO3被聚在一起，DNMT3A绑定HK1和LDHA，而这两个基因作为代谢开关，动物实验表明敲降这两个基因会引起dnmt3a缺失，进一步证明了DNA甲基化与胰腺β细胞的功能直接作用关系［27］。MT-CO3与糖尿病有关［28］。过表达mir-10a会抑制HOXA1并引起胰腺癌局部侵袭［29］。通过研究表明，mir-320c通过SMARCC1在治疗胰腺癌中对药物吉西他宾（gemcitabine） 产生抗药性［30］。模块四当中发现新的集合mir-122-5p、EGLN3、EPAS1，其中mir-122与多个miRNAs筛选作胰腺癌血液中的标记物［31］；EGLN3与胰腺癌肿瘤细胞的分化、增殖有关［32］；干扰EPAS1用作治疗胰腺癌疾病［33］。模块五中YWHAH、FOXO3、CDC25C、YWHAB、YWHAZ与模块二中的集合相同，mir-125a-5p、TCEB2、EPAS1单独聚在一起，降低mir-125a-5p的表达，会抑制胰腺肿瘤的增殖和细胞周期，并促进早期癌细胞的凋亡［34］。TCEB2m则可能用于卵巢癌的治疗［35］。

2.3 模块功能分析

五个模块分别进行GO功能注释（图5），以上五个模块注释来看，在多个模块或同一模块当中多次出现注释到一对相反的功能上，如:positive regulation of biological process和process、negative regulation of biological process；positive regulation of metabolic process、 negative regulation of metabolic process等，这表明在组织自身原来就存在着平衡调控机制，这些功能的失衡可能会引起疾病发生。多个模块注释到代谢相关的功能上，从功能上说明疾病也与代谢密切相关。另外除了细胞周期的功能之外，还有甲基化功能也被注释。通过功能注释表明多个基因通过协同在多个模块中来行使某一功能，而多个相同的功能可能通过多个基因在不同的途径下实现。

图4 miRNAs-mRNAs模块图

图5 模块功能注释

3 结语

为了明确胰腺癌中miRNAs与mRNAs如何行使调控作用，通过对胰腺癌芯片数据进行分析，得到miRNA-mRNAs网络，对网络进行模块挖掘获得5个显著性模块，对模块进行分析，mir-615-3p、mir-222、mir-93-5p、mir-415-3p、mir-877在网络中起到了HUB节点的作用，其中mir-222在表达谱中差异表达。在模块当中还有一些节点度虽然比较小，通过聚类方式发现这些结点以“团队”合作的方式行使功能，如:YWHAH、FOXO3、CDC25C、YWHAB、YWHAZ，通过文献也发现这些成员与胰腺癌的发生都有密切关系。从功能上多个模块中出现相反的功能注释，如:positive regulation of cellular process、negative regulation of cellular process。一方面表明这些模块中存在着的行使相同功能的基因，另一方面也表明，在同一模块当中一些基因在平衡着这些功能起到重要作用。从功能注释到甲基化，说明癌症的发生机制十分复杂，是多阶段、多因素复杂作用的结果。

最后，通过本文的研究，发现miRNAs与mRNAs协同作用的一些结果，为今后更深入的研究胰腺癌提供指导和借鉴。

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miRNAs and mRNAs gene expression profile analysis in pancreatic cancer

BAI Xue-feng， LIU Yue-juan， QI jing， ZHANG jian
（Department of Medical Informatics， Harbin Medical University， Daqing， 163319， China）

In this paper，we study miRNAs-mRNAs regulatory mechanism about pancreatic cancer。Application of bioinformatics method，we set up the miRNAs-mRNA disease network by the pancreatic cancer expression profile，and obtain five significance functional module by mining module of plugins .The larger degree nodes of miRNAs play a role HUB node in this network，while these are closely related to the initial and development of pancreatic cancer. whereafter use of clustering method to each module. the small degree nodes are gathered a collection，of these are more closely related to pancreatic cancer. The GO annotation of genes showed that pancreatic cancer was closely correlated to the metabolism function； moreover，many of same functional annotation appear in multiple modules，while many contrary of functional annotation appear in the single module. This suggests that there is a balance in its original regulatory mechanism.In this paper，achieved some synergy results about of miRNAs-mRNAs，these results may provide reference and help for future disease research on pancreatic cancer。

Pancreatic cancer；mRNAs；mRNAs；Synergy

黑龙江省卫生厅科研课题（编号:2013116）

白雪峰，男，讲师，主要研究方向生物信息学。