响应面法优化虎斑乌贼墨多糖提取工艺的研究

江茂旺,高晓兰,韩庆喜,彭瑞冰,蒋霞敏

(宁波大学海洋学院,浙江宁波 315211)



响应面法优化虎斑乌贼墨多糖提取工艺的研究

江茂旺,高晓兰,韩庆喜,彭瑞冰,蒋霞敏*

(宁波大学海洋学院,浙江宁波 315211)

为了探究虎斑乌贼墨多糖的最佳提取工艺,以虎斑乌贼墨为原料,通过单因素实验研究了加酶量、料液比、加热温度、加热时间和pH对虎斑乌贼墨多糖提取率的影响,在此基础上对加酶量、料液比、加热温度和pH进行响应面优化。实验结果表明:最佳组合为加酶量46 mg/g、料液比1∶19.7 g/mL、温度54.1 ℃、pH9.0、加热时间4 h,此时多糖得率高达2.140%。

虎斑乌贼,墨多糖,提取,响应面法,多糖得率

乌贼墨多糖(Squid ink polysaccharides,SIP)是一种新型海洋生物活性多糖,具有特殊结构及多种生物学功能,包括抗菌[1]、抗氧化[2]、抗肿瘤[3-4]、抗癌[5]、化疗保护及增强免疫力[6-7]等功能。同时,谷毅鹏等[8-9]研究得到通过SIP作用环磷酰胺对睾丸、卵巢的氧化损伤,能够显著抑制环磷酰胺导致超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活力降低和卵泡刺激素、黄体生成素等含量升高。乌贼墨多糖脱蛋白工艺研究表明[10],采用Sevag-酶法进行多糖脱蛋白处理效果较好,其作用较温和,对多糖损失率及活性影响较小;而三氯乙酸酸性较强、作用剧烈,会导致多糖含量降低及活性物质的降解,从而影响多糖提取率及其活性。目前有关乌贼墨多糖提取方法及工艺的研究鲜有报道,仅见于吴金龙[11]、孙楠楠[12]采用正交实验对曼氏无针乌贼(Sepiallamaindroni)和金乌贼(Sepiaesculenta)乌贼墨多糖进行提取。

虎斑乌贼(Sepiapharaonis)隶属软体动物门(Mollusca)、头足纲(Cephalopoda)、十腕目(Decapoda)、乌贼科(Sepiidae)和乌贼属(Sepia),是我国东海、南海重要的经济头足类[13]。其具有个体大(体重可达5 kg以上)、生长快、墨囊重达100 g以上等特点,是一种极具养殖发展前景的品种,国内外学者研究主要集中在营养成分[14]、繁殖生物学[15-16]和养殖技术[17]等方面。而在食品加工过程中,乌贼墨常作为废弃物被处理,其药用价值和潜在的经济价值没有得到较好的利用,值得进一步研究开发。有关虎斑乌贼墨多糖提取工艺未见报道,因此,本文采取单因素实验和响应面优化法进行了乌贼墨多糖的提取工艺研究,为虎斑乌贼墨的综合利用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

AEL-40SM型分析天平日本岛津公司;S.HH.W21型三用电热恒温水浴箱北京长安科学仪器厂);GTSONIC-L3型超声清洗机广东固特超声股份有限公司;UV-3900型紫外可见分光光度计日本日立公司;KDC-160HR型高速冷冻离心机科大创新股份有限公司中佳分公司;N-1000型旋转蒸发仪托普仪器有限公司;FD-1A-50型真空冷冻干燥机北京博医康实验仪器有限公司;-86 ℃超低温冰箱Eppendorf Premium U570艾本德中国有限公司。

1.2实验方法

1.2.1虎斑乌贼墨多糖的提取将-80 ℃冷冻乌贼墨囊取出,放入冰箱(4 ℃)条件下解冻完全,用解剖刀剪开墨囊,去囊膜,取1.00 g墨汁,用蒸馏水调和墨汁成底物,取1L、10 mol/L的NaOH和1 mol/L的 HCl调节pH至8.0,超声处理后,选取碱性蛋白酶,放入水浴锅进行酶解。酶解后迅速放入100 ℃水浴中灭酶10 min,冷却至室温,采用高速冷冻离心机进行离心(8000 r/min)10 min,取上清液,加1/4(v/v)15%三氯乙酸,4 ℃冷藏12 h,旋转蒸发至体积小于1/5,调节pH为7,加入4倍体积无水乙醇,4 ℃冷藏12～16 h,再冷冻离心(8000 r/min)10 min,弃上清液,采用真空冷冻干燥机冷冻干燥24～48 h,得到粗多糖样品[18-19]。

1.2.2虎斑乌贼墨多糖得率的测定采用苯酚-硫酸法测定样品中多糖含量[20]:用水溶解一定量粗多糖产物,定容至50 mL,取0.2 mL于25 mL比色管中,以蒸馏水补至2 mL,依次加入5%苯酚液1.0 mL、浓硫酸5.0 mL混匀。室温静置30 min后,490 nm处测定吸光度值,吸光度与多糖换算回归方程为:C=0.1231A+0.0012,R2=0.9956;其中C为吸光值,A为葡萄糖含量(mg/mL)。

1.2.3单因素实验设计

综上所述，在进行公路道路施工的时候，通过运用改性沥青，能够显著的提升公路的质量，因此，其有着十分广阔的发展空间。通过对改性沥青进行使用，能够有效的提升路面的抗压性，以此来延长其使用寿命，减少各种不必要的维护费用。除此之外，在运用改性沥青的时候，相关的工作人员务必要对其进行精心的拌和以及运输，尽自己最大的努力来避免由于操作不当而造成改性沥青的性能出现下降的情况。

1.2.3.1不同加酶量对虎斑乌贼墨多糖得率的影响选取加酶量(碱性蛋白酶的质量与底物质量的比值)35、40、45、50、55 mg/g五个梯度,放入水浴锅进行酶解,控制料液比1∶15 g/mL、温度50 ℃、酶解时间4 h。

1.2.3.2不同料液比对虎斑乌贼墨多糖得率的影响选取料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL五个梯度,固定加酶量为45 mg/g,加热温度为50 ℃,加热时间4 h,pH为8,其他条件同1.2.1。

1.2.3.3不同加热温度对虎斑乌贼墨多糖得率的影响选取加热温度为40、45、50、55、60 ℃五个梯度,加酶量为45 mg/g,料液比为1∶20 g/mL,加热时间4 h,pH为8,其他条件同1.2.1。

1.2.3.4不同加热时间对虎斑乌贼墨多糖得率的影响选取加热时间为1、2、3、4、5 h五个梯度,加酶量为45 mg/g,料液比为1∶20 g/mL,加热温度为55 ℃,pH为8,其他条件同1.2.1。

1.2.3.5不同pH对乌贼墨多糖得率的影响选取pH为7.0、8.0、9.0、10.0和11.0五个梯度,加酶量为45 mg/g,料液比为1∶20 g/mL,加热温度为55 ℃,加热时间为4 h,其他条件同1.2.1。

1.2.4响应面实验设计由单因素实验结果,选取加酶量、料液比、加热温度和pH四个因素,根据Box-Beknhen中心组合实验设计原理,设计4因素3水平的响应面实验,响应面实验因素与水平见表1。

表1　响应面实验因素与水平表

1.3数据分析与统计

所有实验重复三次,实验数据采用Excel 2003和SPSS 17.0统计分析软件进行相关分析,以p<0.05作为差异显著性判断标准;Box-Beknhen实验设计和结果分析采用Design-Expert 8.0.6软件。

2　结果与分析

2.1单因素实验

2.1.1不同加酶量对虎斑乌贼墨多糖得率的影响由图1可知,在加酶量为45 mg/g,多糖得率达到最高(1.63%±0.06%),并与其他加酶量条件时提取率差异极显著(p<0.01),随着加酶量的增加,多糖得率出现先增后减的趋势,这与孙楠楠等[10]报道一致。加酶量过少底物反应不充分,多糖得率不足;加酶量过多会造成碱性蛋白酶浪费,增加成本投入。故根据实验结果,选取加酶量为45 mg/g作为响应面考察条件。

图1　加酶量对虎斑乌贼墨多糖得率的影响Fig.1　Effect of enzyme dosage on extraction yield of Sepia pharaonis squid ink polysaccharides注:图中不同字母表明差异性显著(p<0.05),相同字母表示无显著性差异(p>0.05),图2～图5同。

2.1.2不同料液比对虎斑乌贼墨多糖得率的影响由图2可知,随着料液比的增加,多糖得率出现先增后减的趋势,当料液比达到1∶20 g/mL,多糖得率达到最高(1.65%±0.04%),并与其他料液比条件时提取率差异显著(p<0.05),这与孙楠楠等[10]报道一致。料液比太高,会使酶的作用浓度减少,影响酶解效率;同时会引起后续操作体积过大而增加消耗。故根据实验结果,选取料液比为1∶20 g/mL作为响应面考察条件。

图2　料液比对虎斑乌贼墨多糖得率的影响Fig.2　Effect of solid-liquid ratio on extraction yield of Sepia pharaonis squid ink polysaccharides

2.1.3不同加热温度对虎斑乌贼墨多糖得率的影响由图3可知,当水解温度为55 ℃,多糖得率达到最高(1.92%±0.03%),并与其他加热温度条件时提取率差异极显著(p<0.01),这与孙楠楠等[10]报道一致,随着温度的升高,多糖得率出现先增后减的趋势。可能是因为酶解温度较低时,碱性蛋白酶的水解活性较低,同时温度较低时化学反应速率较低;当温度过高会影响酶活，同时会增加多糖的降解,多糖得率反而会下降。故根据实验结果,选取加热温度55 ℃作为响应面考察条件。

图3　加热温度对虎斑乌贼墨多糖得率的影响Fig.3　Effect of reaction temperature on extraction yield of Sepia pharaonis squid ink polysaccharides

2.1.4不同加热时间对虎斑乌贼墨多糖得率的影响由图4可知,随着加热时间增加,多糖得率出现先增后减的趋势,在加热时间为4 h时,多糖得率最高(1.89%±0.08%),这与吴金龙等[9]报道一致。但随着加热时间增加,多糖得率差异不显著(p>0.05)。故实验中选择4 h进行多糖的萃取,并且不作为响应面考察条件。

图4　加热时间对虎斑乌贼墨多糖得率的影响Fig.4　Effect of reaction time on extraction yield of Sepia pharaonis squid ink polysaccharides

2.1.5不同pH对乌贼墨提取率的影响由图5可知,pH为9时,多糖得率最高(1.93%±0.05%),并与其他pH条件时提取率差异显著(p<0.05),说明乌贼墨多糖在pH为9时,稳定性及溶解性较好。pH过高、过低都会使碱性蛋白酶的结构发生改变,水解速率下降,对多糖得率影响较大。故根据实验结果,选取pH=9作为响应面考察条件。

图5　pH对虎斑乌贼墨多糖得率的影响Fig.5　Effect of pH on extraction yield of Sepia pharaonis squid ink polysaccharides

2.2响应面优化实验设计

2.2.1响应面模型的建立采用Design-Expert 8.0.6软件对实验数据进行处理,实验数据通过二次多项式逐步回归拟合,得到二次多元回归模型:PY=2.15+0.034A-5.83310-3B-0.039C-0.012D+0.04AB+0.022AC+0.09AD+0.29BC-0.17BD-0.088CD-0.086A2-0. 42B2-0.17C2-0.33D2,R2=0.9937。

表2　响应曲面法优化实验设计及结果

2.2.2回归模型的方差分析对该模型进行方差分析,由(表3)可知,模型F=158.54,p<0.0001,说明所用模型具有高的显著性。失拟项不显著(p>0.05),表明失拟项相对于纯误差来说不显著,该失拟项说明模型的拟合性较好,可以用于模型分析。其中决定系数R2=0.9937,表明超过99.37%的实验数据可用该模型进行解释,说明该模型的拟合程度高,可靠性强。在一次项中,A、C具有极显著的影响(p<0.01),其他因素影响不显著,由F值可知,各因素对多糖得率的影响大小依次为:加热温度>加酶量>pH>料液比;在二次项中,加热温度、提取液pH达到极显著水平(p<0.01);在交互项中,AB、AC、AD、BC、BD对提取率的交互作用显著(p<0.05),而其他因素之间的交互作用不显著。表明各实验因子对响应值的影响不是简单的线性关系,而是呈二次关系。

表3　回归模型的方差分析结果

2.2.3响应曲面分析

2.2.3.1加酶量和料液比之间的交互作用的分析由图6可知,加酶量不变的条件下,料液比在1∶10～1∶20增大时,多糖得率急剧增加,并在1∶20附近达到极大值后缓慢降低,与单因素实验结果吻合;而料液比不变时,多糖得率随加酶量无明显变化。由回归模型的方差分析可知,加酶量对多糖得率影响是明显的(p<0.01),料液比对多糖得率影响却是不明显的(p=0.5292)。

图6　加酶量和料液比对多糖得率影响的响应面图Fig. 6　Response surface graph of enzyme dosage and solid-liquid-ratio on the degree of polysaccharide yield

2.2.3.2加酶量和加热温度之间的交互作用的分析由图7可知,加酶量不变的条件下,随加热温度的提高,多糖得率呈现先增加后降低趋势;而当加热温度不变时,多糖提取量随加酶量的增加呈现逐渐增加趋势,但增速趋缓。由回归模型的方差分析可知,加酶量与加热温度间的交互作用显著(p<0.01);且等高线沿加酶量和加热温度轴向方向较温度的密集,说明加酶量和加热温度对多糖得率影响都较大。

图7　加酶量和加热温度对多糖得率影响的响应面图Fig.7　Response surface graph of enzyme dosage and reaction temperature on the degree of polysaccharide yield

2.2.3.3加酶量和pH之间的交互作用的分析图8与图6变化趋势接近,加酶量不变的条件下,pH在7～9增大时,多糖得率急剧增加,并在9附近达到极大值后降低,与单因素实验结果吻合;而pH不变时,多糖得率随加酶量无明显变化。由回归模型的方差分析可知,加酶量与pH间的交互作用显著(p<0.01),等高线沿加酶量轴向方向比pH轴向密集,说明加酶量对多糖得率的影响度比pH的影响大。

图8　加酶量和pH对多糖得率影响的响应面图Fig.8　Response surface graph of enzyme dosage and pH on the degree of polysaccharide yield

2.2.3.4料液比和加热温度之间的交互作用的分析由图9可知,料液比不变的条件下,随加热温度的提高,多糖得率呈现先增加后降低趋势,并在加热温度55 ℃、料液比1∶20达到极大值。由回归模型的方差分析可知,料液比和加热温度间的交互作用显著(p<0.01),等高线沿加热温度轴向方向比料液比轴向密集,说明加热温度对多糖得率的影响度比料液比的影响大。

图9　料液比和加热温度对多糖得率影响的响应面图Fig.9　Response surface graph of solid-liquid-ratio and reaction temperature on the degree of polysaccharide yield

2.2.3.5料液比和pH之间的交互作用的分析由图10可知,当pH不变时,多糖得率随料液比的升高而先上升后又下降,且在pH为9左右变化最显著(p<0.01);当料液比不变时,随pH10～11之间的增加,多糖得率迅速下降。由回归模型的方差分析可知,料液比和pH间的交互作用显著(p<0.01),等高线沿pH轴向方向比料液比轴向密集,说明pH对多糖得率的影响度比料液比的影响大。

图10　料液比和pH对多糖得率影响的响应面图Fig.10　Response surface graph of solid-liquid-ratio and pH on the degree of polysaccharide yield

2.2.3.6加热温度和pH之间的交互作用的分析由图11可知,加热温度不变时,多糖得率随pH增加呈现先增加后降低趋势;pH不变时,多糖得率随加热温度的增加呈现逐渐增加趋势,但增速趋缓。pH和温度的等高线图接近圆形,说明二者之间的交互作用不显著(p>0.05);等高线沿温度轴向方向与pH轴差不多,pH和温度对多糖得率的影响度程度相近。

图11　加热温度和pH对多糖得率影响的响应面图Fig.11　Response surface graph of reaction temperature and pH on the degree of polysaccharide yield

2.2.4验证性实验利用 Design-expert 8.0.6软件求解回归方程,得到乌贼墨多糖的最佳提取工艺条件为:加酶量45.92 mg·g-1、料液比1∶19.65 g·mL-1、加热温度54.1 ℃、pH=9.05,在此条件下乌贼墨多糖提取率理论可达2.158%。为检验该方法的可靠性,考虑到实际操作,将最佳工艺条件修正为:加酶量46 mg·g-1、料液比1∶19.7 g·mL-1、加热温度54.1 ℃、pH=9.0,在此条件下进行多糖提取的验证实验。3次平行实验多糖的实际提取率分别为 2.153%、2.136%及 2.131%,平均值为2.140%,与理论预测值的相对误差为0.83%,说明采用响应面法对虎斑乌贼墨多糖提取进行工艺优化具有实际可操作性。

3　结论

本实验通过Box-Benhnken的中心组合设计响应面法建立了4 个影响因素(料液比、加酶量、提取温度和pH)与响应值(多糖得率)相互作用的数学模型,采用三维图优化了多糖提取指标,在实验考察范围内,各因素对乌贼墨多糖提取率的影响大小顺序为:加热温度>加酶量>pH>料液比;最佳提取工艺参数为碱性蛋白酶加酶量46(mg/g)、料液比1∶19.7(g/mL)、提取温度54.1 ℃、pH为9.0,多糖得率达到2.140%,与理论预测值的相对误差为0.83%,说明采用响应面法对虎斑乌贼墨多糖提取进行工艺优化具有实际可操作性。

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Study on condition optimizing of extraction technique of squid ink polysaccharide fromSepiapharaonisby response surface methodology

JIANG Mao-wang,GAO Xiao-lan,HAN Qing-xi,PENG Rui-bing,JIANG Xia-min*

(School of Marine Sciences,Ningbo University,Ningbo 315211,China)

To explore the optimum extraction conditions of squid ink polysaccharides fromSepiapharaonissquid ink,this study was conducted to provide a theoretical basis for the development and utilization of squid ink. By single factor tests,enzyme dosage,solid-liquid ratio,reaction temperature,reaction duration and pH were investigated. And on the basis of single factor tests,according to the(Box-Behnken)experimental design protocol,enzyme dosage,solid-liquid-ratio,reaction temperature,and pH were selected to the four factors and the response surface experiment was carried out by response surface analysis. The results showed that their optimal conditions were defined as follows:enzyme amount 46 mg/g,solid-liquid-ratio 1∶19.7,reaction temperature 54.1 ℃ and pH9.0. Under this condition,the polysaccharide yield was as high as 2.140%.

Sepiapharaonis;squid ink polysaccharides;extraction;response surface methodology;yield of polysaccharide

2016-01-06

江茂旺(1991-)，男，硕士研究生，研究方向:渔业资源开发与利用,E-mail:icandyjmw@qq.com。

蒋霞敏(1957-)，女，教授，研究方向:水产养殖与饵料生物培养,E-mail:jiangxiamin@nbu.edu.cn。

国家自然科学基金项目(41206114)；宁波市农业科技专项(2014C11001)；宁波市科技重点项目(2011C11002)。

TS254.1

B

1002-0306(2016)18-0261-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.041