Box-Behnken设计响应面法优化超声波辅助双水相法提取玛咖多糖

王全,李红亚,李术娜,王会,李茉莉

(1.河北农业大学 生命科学学院,河北 保定　071001；2.衡水市农机管理总站,河北 衡水　053000；3.湖南农业大学 生活科学技术学院，湖南 长沙　410128)



Box-Behnken设计响应面法优化超声波辅助双水相法提取玛咖多糖

王全1,李红亚1,李术娜1,王会2,李茉莉3

(1.河北农业大学 生命科学学院,河北 保定071001；2.衡水市农机管理总站,河北 衡水053000；3.湖南农业大学 生活科学技术学院，湖南 长沙410128)

利用Box-Behnken设计响应面法优化超声波辅助双水相法提取玛咖多糖的条件.采用玛咖干根为原料，考察了提取温度、提取时间、料液比3个因素对提取结果的影响.在单个变量因子实验基础上，通过采用Box-Behnken设计响应面分析法对玛咖多糖的超声波双水相提取条件进行优化.最佳提取条件为提取温度60 ℃、料液比1∶20(质量比)、提取时间52 min.与二次方程的拟合度在0.815 3，得到玛咖多糖的提取率为15.831%，与实测值15.732%基本一致.Box-Behnken响应面法用于优化超声波辅助双水相法提取玛咖多糖的条件是可行的，模型预测效果较好，优化条件具备可行性.

玛咖多糖；Box-Behnken 设计；超声波提取；双水相

玛咖(Maca)是1年生或2年生的草本植物，属于十字花科(Cruciferae)植物的一种[1].玛咖中含有丰富的营养成分，如蛋白质、氨基酸、多糖、维生素、不饱和脂肪酸和矿物质等，其根中不饱和脂肪酸的含量较高，占已知脂肪酸总量的56%以上，并且其富含的亚麻酸和亚油酸对人体健康有益.另外，玛咖根中含有18种左右的氨基酸和多种金属离子，其中包括人体必需的8种氨基酸，由于氨基酸组成合理，对谷物类蛋白有较好的平衡作用[2].玛咖的次生代谢物质主要有玛咖酰胺、玛咖烯、芥子油苷、异硫氰酸酯、甾醇及其衍生物[3].此外，玛咖的根中还含有微量的单宁、硫氰酸苄、皂角苷等次生代谢物质[4].

玛咖富含多种营养物质以及活性物质，有非常合理的营养结构，它具有提高生育能力的保健功能和治疗贫血、抑郁症以及中老年人的更年期综合症、风湿等疾病.此外，玛咖还具有抗癌和抗白血病的功效以及抗疲劳、调节内分泌等多种独特的药理作用[5].

多糖是一种天然大分子物质，它是由糖苷键连接醛糖和酮糖而构成的多聚糖，是组成生命体的关键物质，也是维持生命体的基本能源物质[6].玛咖多糖在医药中的主要作用包括抗肿瘤、抗辐射、抗病毒、抗炎、抗疲劳、抗衰老、降血糖、降血脂、免疫调节等功能[7].目前最常用的多糖提取方法主要有水提法，如陈燕青[8]等用水提醇沉法提取玛咖多糖后进行含量测定，结果显示出较好的重现性，但是方法操作时间长，提取率低；酸碱法，如孟宪云[9]等用质量分数5%硫酸铵溶液和水2种方法提取茜草多糖，发现稀酸提取法产品纯度相对较高.赵云平[10]用0.1 mol/L氢氧化钠提取知母多糖，多糖得率22.078%，但是酸碱会引起多糖的降解及糖苷键的断裂，因此操作时间不宜过长；酶法，如Hauke Hilz等应用酶分离得到了更多的果胶多糖，此方法回收率高，节约能耗，但是提取成本较高；微波法，如胡灵[11]等利用微波辅助技术提取灵芝多糖，结果比对照组的多糖提取率明显提高.柳志宇[4]分别利用聚能式和扩散式超声设备对玛咖多糖进行了提取，达到了较好的效果，提取率分别为15.26%和13.25%.本实验采用超声波[12-13]与双水相萃取技术[14-15]相结合的方法来提取玛咖多糖.双水相萃取法是利用目标物质在上、下两相之间的分配系数不同，使两相中目标物质的浓度出现不同，进而实现分离的目的.双水相萃取法对目标物质回收率高，耗能小，操作条件温和，利于后续提纯工作.本实验采用Box-Behnken响应面分析法[16]对玛咖多糖的超声波双水相提取工艺进行优化，建立回归模型，取得了吗咖多糖的最佳提取条件，为玛咖多糖的提取提供了参考.

1　仪器与试剂

数控超声波清洗器、TD5A-WS台式低速离心机，赛特湘仪离心机仪器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵，河南省予华仪器有限公司；旋转蒸发器RE-52AA，河南省予华仪器有限公司；2802UV/VIS分光光度计，上海美谱达仪器有限公司.玛咖干根细粉，秘鲁；体积分数6%苯酚溶液，DNS溶液，Sevag试剂，浓硫酸(分析纯)，PEG-400(分析纯)，葡萄糖(分析纯).

2　方法与结果

2.1总糖及还原糖含量的测定

以葡萄糖为标准，采用苯酚-硫酸法进行总糖含量的测定[17]；以葡萄糖为标准，采用DNS法进行还原糖含量测定.

2.2多糖含量的测定

多糖量的计算见公式(1)

(1)

式中，m多为多糖质量，mg；m总为总糖质量，mg；m还为还原糖质量，mg.

含糖量的计算见公式(2)

(2)

式中，m多为多糖质量，mg；m原料为原料质量，mg；m含糖量为多糖的百分含量.

2.3标准曲线的建立

苯酚-硫酸法测定总糖含量获得的总糖标准曲线方程为y=6.897x-0.026，其中x代表总糖的质量(mg)，y代表吸光度值，R2为0.999，线性关系良好.

DNS法测定还原糖含量获得的还原糖标准曲线方程为y=1.312x-0.046，其中x代表还原糖的质量(mg)，y代表吸光度值，R2=0.998，线性关系良好.

2.4双水相系统的制备[18]

采用聚乙二醇/硫酸铵作为双水相体系，取一定体积的多糖提取液样品，通过加入不同比例的PEG-400和硫酸铵，观察其是否分相以及分相的速度和得到的上相与下相的体积比，最终确定加入的PEG-400占总体系的16.00%，硫酸铵占总体系的22.00%.

2.5玛咖多糖的提取[19]

称取玛咖块根粉末5.00 g，按一定的料液比例加入蒸馏水，在一定温度下水浴超声提取一定时间(超声功率为200 W)，离心分离上层清液，并浓缩至原体积的1/5，将浓缩液冷却.用Sevag法除蛋白质.取一定体积浓缩液，加入适量PEG-400，充分溶解后，按一定质量比加入(NH4)2SO4，超声混匀，静止分相，用分液漏斗分离，取其下相保存，备用.

2.5.1提取温度对玛咖多糖提取率的影响

料液比1∶20(质量比)，提取时间30 min，提取温度分别为40，50，60，70，80 ℃，按照2.5的实验路线提取玛咖多糖，并测定多糖提取率.实验结果如表1所示.

表1　温度对玛咖多糖提取率的影响

由表1数据作折线图，如图1所示.

图1　温度对玛咖多糖提取率的影响Fig.1　Effect of temperature on extraction rate of polysaccharide from Maca

结果表明，玛咖多糖提取率随着温度的上升而逐渐增高，当在60 ℃时达到最大值，之后有微小地下降趋势.这可能由于随着温度的升高，玛咖多糖在水中的溶解度增大，进而多糖的提取率上升.但是在温度上升的同时，多糖在较高的温度下的分解也会增加，因此选择60 ℃为实验提取温度.

2.5.2料液比对玛咖多糖提取率的影响

在提取温度60 ℃，提取时间30 min的条件下，分别按料液比(质量比)1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30加入蒸馏水，按照2.5的实验路线提取玛咖多糖，并测定多糖提取率.实验结果如表2所示.

表2　料液比对玛咖多糖提取率的影响

由表2数据作折线图，如图2所示.

结果表明，玛咖多糖的提取率随着料液比的增大而逐渐上升，而当料液比高于1∶20(质量比)时，玛咖多糖的提取率随着料液比的增大而有所提高.玛咖多糖随着料液比的增大，在水中溶解的越充分，但是提取增加不大，因此选择料液比1∶20(质量比)作为实验条件.

2.5.3提取时间对玛咖多糖提取率的影响

在料液比1∶20(质量比)，提取温度60 ℃，提取时间分别为20，30，40，50，60 min的条件下，按照2.5的实验路线提取玛咖多糖，并测定多糖提取率.结果如表3所示.

表3　提取时间对玛咖多糖提取率的影响

由表3数据作折线图，如图3所示.

图2　料液比对玛咖多糖提取率的影响Fig.2　Effect of solid-to-liquid ratio on extraction rate of polysaccharide from Maca

图3　提取时间对玛咖多糖提取率的影响Fig.3　Effect of ultrasonic time on extraction rate of polysaccharide from Maca

结果表明，在低于40 min时，随着时间的增加玛咖多糖的提取率迅速上升，在40 min以后提取率增加缓慢，在提取时间为60 min时达到最大值，这可能由于随着超声时间的增长，玛咖多糖在水中溶解的越充分.但是提取时间在50 min时的提取率已经接近最大值，考虑到能耗与提取率的关系，实验选择50 min.另外，玛咖粉在浸泡0.5 h后超声提取与直接超声提取结果变化不大，总结原因可能为药材粉末由于颗粒较小，在实验的有效时间内即可充分提取；超声提取的效果较彻底.

2.6响应面实验设计

2.6.1 实验设计

基于单因素实验结果，以提取温度60 ℃，料液比1∶25，提取时间50 min为中心点，利用Box-Behnken软件进行响应面实验设计.以提取温度A、提取时间B、料液比C为自变量，以多糖提取率Y为响应值，利用响应面设计软件分析实验结果.

表4　响应面设计的因素与水平表

由响应面设计软件设计实验方案，其方案结果如表5所示.

表5　响应面分析程序及实验结果

根据表5的方案条件，按照2.5的实验方法进行实验，零水平实验重复5次，用以估计实验误差[20].最终将得到玛咖多糖的提取率.

2.6.2回归模型的建立及方差分析

以玛咖多糖提取率为指标，采用Box-Behnken软件对表5中的数据进行回归分析，回归分析结果见表6.各因素经过回归拟合后，获得玛咖多糖提取率对编码自变量提取温度、料液比、提取时间的二次多项回归方程

Y =14.47+0.37A+1.04B-0.38C-0.13AB-2.24AC+0.22BC-1.04A2-1.78B2-0.64C2.

P<0.000 1极显著；P<0.050 0显著.

经Box-Behnken软件分析，Model(模型)的F值是18.23(P<0.001 0)，表明该模型非常显著.因素的显著性检验结果显示，交互因素AC(即提取温度和料液比交互作用)P值小于0.000 1，说明其对玛咖多糖提取率有极显著的影响；提取时间的二次项B2、提取时间B、提取温度的二次项A2的P值均小于0.050 0，说明对玛咖多糖提取率影响显著；其他因素的P值大于0.100 0，说明无显著影响[21-22].相对于纯误差失拟项的F值1.60(P=0.322 8>0.050 0)，表明失拟项的差异不显著，实验的拟合性较好.

表7　玛咖多糖提取的二次多项式拟合分析

为了研究2因素之间交互作用对玛咖多糖提取率的影响，将其中一个因素固定在零水平，选取剩余2个因素对玛咖多糖提取率进行响应面分析.如图4所示，曲面上相同提取率所对应的因素值在底面上形成曲线，即为等高线图.等高线的形状可以清晰地反映出2因素交互作用对玛咖多糖提取率影响的强弱.等高线越接近圆形，说明交互作用对提取率影响越弱；等高线越接近椭圆形，说明交互作用对提取率影响越强；在等高线的圆心处附近存在极值的条件[21].从图4a、b可以看出，当提取温度保持不变时，玛咖多糖提取率随提取时间的升高而增大，曲面的斜率较大.当提取时间保持不变时，多糖提取率随提取温度的升高变化不明显，曲面斜率相对较小.说明提取时间对玛咖多糖提取率的影响较为显著.从图4c、d可以看出提取温度与料液比交互作用形成的曲面最陡，说明对多糖提取率的影响最显著.从图4e、f可以看出提取时间与料液比的交互作用对多糖提取率的影响较弱[23-24].

图4　响应面及等高线图Tab.4　Response surface and contour plots

2.7验证实验

通过Box-Behnken软件求解回归方程，得到玛咖多糖的最佳提取条件：提取温度60 ℃，料液比(质量比)1∶20，提取时间51.95 min，在此条件下，多糖提取率的理论值为15.831%.结合实际操作情况，对实验条件进行一定的修改，在60 ℃、1∶20(质量比)的料液比、提取时间52 min条件下，实验结果如表8所示.

表8　验证实验结果

结果表明，软件的预测值为15.831%，在提取温度为60 ℃，料液比(质量比)1∶20，提取时间为52 min的实际操作条件下，测得玛咖多糖提取率为15.732%.实验值与理论预测值十分接近，说明了该模型在实际预测上的可用性，可以利用响应曲面法优化玛咖多糖的提取条件.

3　结论

通过单因素实验考察了温度、料液比、超声时间对玛咖多糖提取率的影响，在此基础上采用响应面分析法对提取工艺进行优化，建立了回归数学模型.通过模型，得到最佳提取条件为温度60 ℃、料液比(质量比) 1∶20、超声时间 51.95 min，在此条件下预测玛咖多糖提取率为15.831%.经过实验验证，该条件下的多糖的提取率达到15.732%，与预测值基本一致，优化效果明显，为玛咖多糖的提取提供实验基础.

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(责任编辑：梁俊红)

Box-Behnken design for optimized extraction of polysaccharides from maca via ultrasonic-assisted aqueous two-phase method

WANG Quan1,LI Hongya1,LI Shuna1,WANG Hui2,LI Moli3

(1.College of Life Science,Agricultural University of Hebei,Baoding 071001,China; 2.Agricultural Machinery Management Station of Hengshui,Hengshui 053000,China； 3.College of Biological Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128,China)

maca polysaccharide;box-Behnken design;ultrasonic extraction;aqueous two-phase

10.3969/j.issn.1000-1565.2016.04.010

2015-08-20

国家自然科学基金青年基金资助项目(20905019)

王全(1980—)，男，河北衡水人，河北农业大学讲师，河北大学在读博士，主要从事天然药物提取与分析的研究.

E-mail：wangquan210@163.com

O629

A

1000-1565(2016)04-0387-09