液相色谱串联质谱法快速测定动物组织中克百威及其代谢产物残留量

杨挺++吕燕++陈国++吴银良

摘 要：建立快速测定动物组织中克百威及其代谢产物三羟基克百威残留量的液相色谱串联质谱（liquid chromatography with tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）分析方法。动物组织样品中残留物利用乙腈提取，提取后溶液经N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）和C18材料净化，净化后的提取液经氮吹后用0.1%甲酸溶液-乙腈（50∶50，V/V）溶解，进行LC-MS/MS分析。采用Acquity BEH C18色谱柱分离，用0.1%甲酸溶液-乙腈作为流动相进行梯度洗脱，电喷雾正离子（ESI+）模式电离，多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式检测，内标法定量。克百威和三羟基克百威分别在0.05～25.0 μg/L和0.25～50.0 μg/L质量浓度范围内具有良好的线性关系，线性相关系数均大于0.999；在动物组织（猪肉和牛肉）中克百威和三羟基克百威的方法检测限分别为0.10 μg/kg和0.50 μg/kg，定量限分别为0.25 μg/kg和1.0 μg/kg。添加范围为0.25～10 μg/kg时，平均回收率在95.7%～107.0%之间，批内相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）在3.2%～5.9%之间，批间RSD在4.5%～6.6%之间。该方法能满足动物肉组织中克百威及其代谢产物残留量快速分析的要求。

关键词：动物组织；克百威；三羟基克百威；快速测定；液相色谱串联质谱法；残留量

Fast Determination of Residues of Carbofuran and Its Metabolite in Animal Tissues by Liquid Chromatography

with Tandem Mass Spectrometry

YANG Ting， L? Yan， CHEN Guo， WU Yinliang*

（The Ningbo Academy of Agricultural Sciences， Ningbo 315040， China）

Abstract： A method for determining residues of carbofuran and its metabolite 3-hydroxycarbofuran in animal tissues was developed by liquid chromatography with tandem mass spectrometry. Samples were extracted with acetonitrile. Then the extract was purified by dispersive solid phase extraction method using PSA and C18 as sorbents. After purification， the extract was dried under nitrogen stream and the residue was dissolved in 0.1% formic acid solution/acetonitrile mixture （50/50， V/V）

and filtered through a 0.22 ?m filter and 10 ?L of the filtrate was injected into the LC system for analysis. The analysis was performed on an Acquity BEH C18 column with a mixture of 0.1% formic acid solution and acetonitrile as the mobile phase under gradient elution conditions. The mass spectrometer was operated in multiple reaction monitoring （MRM） mode with positive ion electrospray ionization （ESI）. The analytes were quantified with the isotope internal standard dilution method. Good linearity was obtained for carbofuran and 3-hydroxycarbofuran in the concentration range of 0.05–25.0 and

0.25–50.0 μg/L with correlation coefficients more than 0.999， respectively. The recoveries in animal tissues （pork and beef） were 95.7%–107.0% at fortified levels of 0.25–10 μg/kg with limits of detection of 0.10 and 0.50 μg/kg and limits of quantitation of 0.25 and 1.0 μg/kg for carbofuran and 3-hydroxycarbofuran， respectively. The relative standard deviations of intra- and inter-batch assays were between 3.2% and 5.9%， and between 4.5% and 6.6%， respectively. The method was demonstrated to be suitable for the fast determination of residues of carbofuran and its metabolite 3-hydroxycarbofuran in animal tissues.

Key words： animal tissues； carbofuran； 3-hydroxycarbofuran； fast determination； liquid chromatography with tandem mass spectrometry； residue

DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.09.005

中图分类号：TS251.7 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2016）09-0023-06

引文格式：

杨挺， 吕燕， 陈国， 等. 液相色谱串联质谱法快速测定动物组织中克百威及其代谢产物残留量[J]. 肉类研究， 2016， 30（9）： 23-28. DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.09.005. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

YANG Ting， L? Yan， CHEN Guo， et al. Fast determination of residues of carbofuran and its metabolite in animal tissues by liquid chromatography with tandem mass spectrometry[J]. Meat Research， 2016， 30（9）： 23-28. （in Chinese with English abstract） DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.09.005. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

克百威，又名呋喃丹，是一种高效、高毒的氨基甲酸酯类杀虫剂，具有触杀、胃毒和内吸作用，并且兼有杀虫、杀螨和杀线虫的生物活性，对多种害虫有效，其毒理机理是抑制胆碱酯酶活性，且与之结合不可逆，因此对人、畜具有高毒性。克百威的主要代谢产物为3-羟基克百威。我国农业部235号公告附录4规定克百威为禁止在动物中使用的药物，同时在动物性食品中不得检出。因此研究和建立动物组织中克百威及其代谢产物的残留量分析方法对保障动物性食品安全具有重要意义。

目前，对包括克百威在内的氨基甲酸酯类杀虫剂残留的分析方法较多，主要有酶联免疫吸附法[1-3]、液相色谱法[4-11]、气相色谱-质谱法[12-14]和液相色谱串联质谱（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法[15-20]等；然而其中动物性食品中的氨基甲酸酯类杀虫剂分析分方法相对较少，且较多方法并未同时测定克百威的代谢产物3-羟基克百威[11-15]，导致这些方法在实际使用中受到限制；同时较多方法采用较为繁琐的固相萃取方法净化，难以满足克百威及其代谢产物快速分析的需要。本实验考虑到克百威及代谢产物的化学特性，建立了快速提取和净化的前处理步骤，该方法的建立能充分满足动物性食品安全实际监管中测定克百威残留量的需要。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

空白猪肉和牛肉样品 宁波市江东区欧尚超市；克百威（100 mg/L）、3-羟基克百威（100 mg/L） 国家标准物质研究中心；克百威-D3（100 mg/L） 德国Dr. Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈（色谱纯） 美国默克公司；

甲酸（色谱纯） 美国天地有限公司；N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、C18 美国Agilent公司；其他试剂均为分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

液相色谱串联质谱联用仪 美国Waters公司；SIGMA3K15离心机 德国Sigma公司；Milli-Q超纯水仪 美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

1.3.1.1 制作标准曲线工作溶液

用流动相稀释100 mg/L克百威、3-羟基克百威和克百威-D3标准溶液，克百威和3-羟基克百威混合标准工作液的质量浓度为0.25、0.50、2.5、10、25 μg/L，同时配制克百威和3-羟基克百威质量浓度分别为0.05 μg/L和50 μg/L的单一标准工作液，所有上述标准工作液中内标（克百威-D3）质量浓度均为10 μg/L。

1.3.1.2 添加用标准工作液

用乙腈稀释100 mg/L克百威、3-羟基克百威和克百威-D3标准溶液，得质量浓度分别为10、40、400 μg/L的克百威标准工作液，质量浓度分别为40、100、400 μg/L的3-羟基克百威标准工作液，质量浓度为400 μg/L的克百威-D3标准工作液。

1.3.2 样品前处理

准确称取2.0 g动物组织样品于带盖的50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入5 mL乙腈，高速均质1 min后5 000 r/min离心2 min，吸取上层溶液于另一50 mL聚四氟乙烯离心管中，再加入5 mL乙腈重复提取1 次，合并提取液，混匀后吸取2 mL提取液于已加有50 mg PSA和50 mg C18材料的10 mL聚四氟乙烯离心管中，旋涡混合30 s，5 000 r/min

离心2 min，取上清液1.0 mL于40 ℃水浴中用氮气吹干，用0.25 mL 0.10 %甲酸水-乙腈（50∶50，V/V）溶解，过0.22 ?m滤膜后供LC-MS/MS分析。

1.3.3 仪器条件

色谱柱：Acquity BEH C18色谱柱（100 mm×

2.1 mm，1.7 μm）；流动相：A相：0.1%甲酸溶液，B相：乙腈；梯度洗脱条件：B相在0.5 min内保持50%，然后在2.5 min内线性增加到90%，保持0.5 min，然后在0.1 min内降至10%，保持0.9 min；流速0.30 mL/min；进样量10 μL。

ESI源正离子模式电离；多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）；毛细管电压：2.0 kV；萃取锥孔电压：20 V；RF透镜电压：0.5 V；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气温度：500 ℃；锥孔气流速：50 L/h；脱溶剂气流速：1 000 L/h；倍增器电压：650 V；二级碰撞气：氩气；其他条件详见表1。

2 结果与分析

2.1 仪器条件的建立

由于克百威和3-羟基克百威化学结构中含有酰氨基，容易得到H+而形成较为稳定的[M+H]+准分子离子，因此目前所建立的LC-MS/MS分析方法均采用ESI+模式对克百威和3-羟基克百威进行监测。本研究采用“T”三通方式，利用IntelliStart软件获得克百威、克百威-D3及

3-羟基克百威的离子对以及锥孔电压等质谱分析参数，并经优化后得到1.3.3节中的质谱参数。

利用LC分析克百威及3-羟基克百威时，当分别采用0.1%甲酸溶液-乙腈和0.1%甲酸溶液-甲醇进行梯度洗脱分析两者时，2 种溶液作为流动相对两者的响应差异较小，灵敏度差异也较小，而本研究考虑到0.1%甲酸溶液-乙腈作为流动相时同样梯度条件下出峰时间更快，采用0.1%甲酸溶液-乙腈作为流动相对克百威及3-羟基克百威进行分析。利用上述色谱和质谱条件获得的图谱详见图1。

a1～6. 标准溶液；b1～6. 牛肉空白样品；c1～6. 牛肉添加样品。

图 1 0.50 μg/L标准溶液（内标质量浓度10 μg/L）、牛肉空白样品和牛肉添加样品（1.0 μg/kg）色谱图

Fig. 1 Chromatograms of carbofuran and its metabolite in standard solution （0.50 μg/L； 10.0 μg/L internal standard solution）， blank beef and fortified beef sample （1.0 μg/kg）

2.2 前处理条件的选择

在已建立的LC及LC-MS/MS分析氨基甲酸酯类杀虫剂分析中，通常采用乙腈进行提取，然后净化采用固相萃取[15]、凝胶渗透[19]或QuEChERS方法[20]进行，其中QuEChERS方法具有快速、方便和经济的特点，本研究针对克百威及其代谢产物的化学性质，尝试建立利用乙腈提取和QuEChERS净化的前处理方法。然而在实验中发现当用5 mL乙腈对2 g样品中残留物仅提取一次时克百威及其代谢物的提取回收率小于40%，该情况下经后续净化检测发现3-羟基克百威的定量限无法达到1.0 μg/kg；因此为提高提取回收率，方法采用10 mL乙腈均分2 次对样品中的残留物进行提取，结果发现，两者的提取回收率均高于85%，且3-羟基克百威的定量限能达到1.0 μg/kg。在空白样品提取液中加入标准溶液后，未经QuEChERS方法净化直接进行吹干复溶进行测定，发现克百威及其代谢物均有一定的基质抑制，但分别经25 mg PSA/50 mg C18、50 mg PSA/50 mg C18、100 mg PSA/50 mg C18和200 mg PSA/50 mg C18净化发现，当PSA用量达到50 mg及以上时，2 个化合物的基质抑制效应均得到了明显改善，因此本研究中采用50mg PSA和50 mg C18进行实验；同时从图1b和图1c中可见，本实验建立的前处理方法对2 种化合物无杂峰干扰，且峰形较好。

2.3 线性实验

根据1.3.1.1节配制标准工作溶液，对克百威在0.05～25 μg/L和3-羟基克百威在0.25～50 μg/L质量浓度范围内以待测物定量离子对与内标离子对峰面积比值对质量浓度作图，所得标准曲线方程分别为y=0.096 7x+0.004 3（克百威）和y=0.014 6x+0.001 2（3-羟基克百威），相关系数（R2）分别为0.999 8（克百威）和0.999 5（3-羟基克百威），说明本方法适用于克百威及其代谢物残留量的定量分析。

2.4 回收率、精密度和检出限

取空白牛肉和猪肉样品，加入标准工作溶液配制成含有克百威0.25、1.0、10 μg/kg及3-羟基克百威1.0、2.5、10 μg/kg的加标样品，按照1.3.2节进行操作，每个添加水平重复3 次，每次每个添加量5 个加标样品进行定量分析，结果详见表1。

由表1可知，各添加量点平均添加回收率在95.7%～107.0%之间。批内相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为3.2%～5.9%，批间RSD为4.5%～6.6%，可见该方法能满足现行药物残留分析的要求。本实验选择添加实验中响应最低样品的信噪比（RS/N），并按RS/N=3计算克百威和3-羟基克百威的检出限，结果分别为0.10 μg/kg和0.50 μg/kg；按RS/N=10计算定量限，克百威和3-羟基克百威分别为0.25 μg/kg和1.0 μg/kg。

2.5 方法应用

利用该方法在2015年底对宁波市江东区大型超市所售的20 个猪肉和牛肉样品进行了克百威及其代谢产物残留量测定，所有样品均未检出。

3 结 论

本研究建立了快速测定动物组织中克百威及其代谢产物的LC-MS/MS方法，样品从称样到分析完成整个过程约需要25 min。经方法学验证表明，方法具有较好的灵敏度，克百威和3-羟基克百威在动物肉组织中的方法检测限分别能达到0.10 μg/kg和0.50 μg/kg，定量限分别能达到0.25 μg/kg和1.0 μg/kg；同时方法具有较好的准确度和精密度，添加回收率能达到90%～110%，批内RSD和批间RSD均小于10%。总之，该方法具有快速、灵敏、准确的特点，可满足实际监控中测定克百威残留含量的需要。

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