青钱柳中黄酮成分提取工艺的优化及微量元素分析

邓佑林，彭继升，李 芳，朱丽威，于丽敏，王美春，杨盼盼，唐 石

（1.吉首大学化学化工学院，湖南 吉首 416000；2.古丈春风合民族食品开发有限公司，湖南 古丈 416300）

研究与开发

青钱柳中黄酮成分提取工艺的优化及微量元素分析

邓佑林1，彭继升2，李 芳1，朱丽威1，于丽敏1，王美春1，杨盼盼1，唐 石1

（1.吉首大学化学化工学院，湖南 吉首 416000；2.古丈春风合民族食品开发有限公司，湖南 古丈 416300）

采用索氏提取法提取青钱柳中的总黄酮，考察了提取液、溶剂浓度、提取时间和提取次数对总黄酮提取率的影响。实验结果表明，最优化的工艺条件为：乙醇作为提取液，乙醇浓度为 80%，提取时间为2h，提取次数为3次。另外，原子吸收分光光度法分析结果表明，青钱柳提取液含有钾、磷、钙、镁、铁、锰、铜、锌等微量元素。

青钱柳；黄酮；微量元素

青钱柳是仅存在于我国的一种重点保护植物，于冰川世纪幸存下来[1]，在我国南方居多且以湘西南地区为主。青钱柳在湘西南地区一直被当地很多长寿老人称为“神茶”，到20世纪70年代，我国科研工作者发现其优点并进行研究，但对青钱柳药理作用及理化成分的研究则始于20世纪末[2]。

医学分析表明，黄酮等有机成分和微量元素具有抗氧化效果，并且有利于人体免疫功能的提高和改善[3-4]。研究已证实青钱柳中含有大量的黄酮类有机物成分和很多人体所需的微量元素，具有很好的降血压、降血脂、降血糖、增强人体免疫等功能。目前国内已经有利用青钱柳开发的新型保健品和相关药物，其中一种保健茶已经得到美国食品与药品管理局的认可[5-9]，由此可见青钱柳茶在茶产业开发中独领风骚，具有很好的市场前景。

利用湘西的青钱柳进行实验，将丰富青钱柳相关保健产品的种类，若能实现产业化，可以增加当地居民的收入，解决就业问题，这也为青钱柳的综合开发利用，以及寻求经济环保高附加值的产业化开辟新的方向。

1 实验部分

1.1 实验仪器和药品

1.1.1 实验仪器

UV-2450型紫外分光光度计，EX-CG型偏振式能量色散X射线荧光光谱仪，KQ-250E型超声波清洗器，DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器，JA2003N型电子天平，SHB-Ⅲ型台式循环水式多用真空泵，数显恒温水浴锅。

1.1.2 实验试剂与材料

青钱柳（湖南省永顺县）；无水乙醇、硝酸铝、氢氧化钙、甲醇、亚硝酸钠、浓硫酸、双氧水、氢氧化钠（均为分析纯）。

1.2 实验方法

1.2.1 青钱柳样品的预处理

青钱柳嫩芽叶采集于湘西永顺地区，洗净后放入100℃的烘箱内烘烤72h，待青钱柳样品干燥后，将其粉碎至0.25mm备用。

1.2.2 青钱柳中微量元素含量的测定

1）样品溶液的制备：采用硫酸-双氧水消煮法制取样品[10]。将已经粉碎至0.25mm的青钱柳样品称取4.0g，放入250mL的锥形瓶中，并且用蒸馏水将粘附在锥形瓶颈上的样品冲洗进溶液中，用25mL的移液管移取16mL浓硫酸（98%）加入到锥形瓶（放置12h），过氧化氢溶液80滴分5批加入，在电炉上加热硝化，冷却后再用蒸馏水定容于250mL容量瓶中，摇匀备用。

2）测量方法：吸取2.5mL样品定容至25mL的容量瓶中用火焰光度法测定钾；吸取2.5mL样品用二次蒸馏水定容至25mL容量瓶中，用原子吸收分光光度法测定铁、锰、铜、锌、钙、镁等元素。

1.2.3 青钱柳中总黄酮含量的测定

1）乙醇提取方法：将已经粉碎至0.25mm的青钱柳样品分别称取两份各2.0g，装入250mL索式提取器的滤纸筒中，在2个圆底烧瓶中分别加入80%和60%的乙醇各150mL以及沸石，在78℃的水浴中加热，回流提取2h，待索氏提取器中的冷凝液刚刚被虹吸下去时停止加热。滤渣相应地加80%和60%乙醇各50mL，再回流提取0.5h，过滤，滤渣用10mL乙醇（80%和60%）溶液各洗涤3次。合并滤液与洗液，用石油醚脱色2次，每次使用20mL，将醚层去除，将溶液用80%和60%的乙醇定容至250mL容量瓶。

2）水提取方法：将已经粉碎至0.25mm的青钱柳样品称取两份各2.0g，放入250mL索式提取器的滤纸筒中，在圆底烧瓶中加入蒸馏水150mL以及沸石，在100℃的水浴锅中回流，回流提取时间2h，待索氏提取器中的冷凝液刚刚被虹吸下去时停止加热。滤渣用蒸馏水回流提取0.5h，过滤后的滤渣用30mL蒸馏水分3次洗涤。合并2次蒸馏的滤液与3次洗涤的洗液，将溶液用蒸馏水定容至250mL容量瓶。

1.2.4 对照品溶液的制备

1）芦丁标准溶液的制备：用电子天平精密称取2.75mg已在120℃的干燥箱内干燥至恒重的芦丁对照品，用80%乙醇定容至25mL容量瓶中，可得0.11mg·mL-1的芦丁对照样品。

2）槲皮素标准溶液：用电子天平精密称取6mg已在120℃的干燥箱内干燥至恒重的槲皮素对照品，用80%乙醇定容至50mL容量瓶中，可得0.12mg·mL-1的槲皮素对照样品。

2 结果与讨论

2.1 微量元素提取

青钱柳中提取的微量元素含量用下面的公式进行计算：

式中：M为微量元素含量，mg·(100g)-1；V为萃取液的体积，mL；m为样品质量，g；y为空白溶液的浓度；x为样品溶液的浓度。

表1 青钱柳中提取的微量元素含量测定结果 /×10-6

2.2 提取总黄酮的结果

2.2.1 芦丁含量的测定

取2支30mL具塞试管，分别加入青钱柳提取液、芦丁对照品溶液各2mL，依次加入60%的乙醇10mL，用移液管移取5%亚硝酸钠0.6mL，摇匀，放置6min，后加入10%的硝酸铝0.6mL，再放置6min，加5%氢氧化钠8mL，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置15min后以蒸馏水为空白对照进行扫描。在500nm处芦丁有最大吸收，使样品成为暗红色。扫描得出样品在498nm处有一吸收峰。实验结果显示，青钱柳样品的最大吸收峰与芦丁有很好的重合度。

图1 乙醇和水提取、硝酸铝络合后的紫外可见光谱图（芦丁）

2.2.2 槲皮素含量的测定

取2支30mL具塞试管，分别加入青钱柳提取液、槲皮素对照品溶液2mL，依次加入60%的乙醇10mL，用移液管移取5%亚硝酸钠0.6mL，摇匀，放置6min后，加入10%的硝酸铝0.6mL，再放置6min，加5%氢氧化钠8mL，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置15min后以蒸馏水为空白对照进行扫描。在316nm处槲皮素有最大吸收，样品显色后为暗红色，本实验扫描得出青钱柳样品在316nm处有一吸收峰。

图2 乙醇和水提取硝酸铝络合后的紫外可见光谱图（槲皮素）

2.2.3 最佳反应条件的摸索

首先对青钱柳提取工艺中的提取液进行了探索。分别以80%乙醇、60%乙醇和水为提取液，对青钱柳叶进行提取。实验过程中发现，乙醇作为提取液时的提取率高于水提取时的提取率，其中80%的乙醇提取液对青钱柳黄酮含量的提取率最高，不同提取液提取的黄酮紫外可见光谱图如图3所示。

图3 乙醇和水提取紫外可见光谱图（芦丁）

实验还对青钱柳的提取时间进行了探索。分别以80%乙醇、60%乙醇和水为提取液，对青钱柳叶进行提取，并且选用不同的提取时间进行探索。实验过程中发现，2h的提取时间，青钱柳中黄酮物质的提取率最高。不同提取液提取的黄酮紫外可见光谱图如图4、图5、图6所示。

图4 80%乙醇提取（2h）硝酸铝络合后的紫外可见光谱图（芦丁）

2.2.4 总黄酮含量的计算

图5 60%乙醇提取（2h）硝酸铝络合后的紫外可见光谱图（芦丁）

图6 蒸馏水提取（2h）硝酸铝络合后的紫外可见光谱图（芦丁）

取12只30mL具塞试管，分别用移液管吸取芦丁样品溶液和槲皮素样品溶液0.0mL、2.0mL、4.0mL、 6.0mL、8.0mL、10.0mL，加60%的乙醇10.0mL，加5%亚硝酸钠0.6mL，摇匀，放置6min，加10%硝酸铝0.6mL，再放置6min，加5%氢氧化钠8.0mL，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置15min后以零管作为空白，于200~600nm波长下测定相应标准品的吸光度。以芦丁含量(μg)对吸光度作图，得出其标准曲线，以槲皮素含量(mg)对吸光度作图，得出其标准曲线。

芦丁的标准曲线：A=0.01204C- 0.00263，R2=0.9996

槲皮素的标准曲线：C=119.41A+0.0204，R2=0.9994

式中：C为标准溶液浓度，mg·mL-1；A为吸光度。

表2 3种提取液提取2h的总黄酮含量

本实验中用硝酸铝显色法显色，其原理是先用亚硝酸钠还原黄酮类物质，再加硝酸铝与黄酮类物质络合，最后为了使黄酮类化合物开环，生成新物质2’-羟基查耳酮而向其中加入氢氧化钠溶液。总黄酮含量为其黄酮类成分的总量，非黄酮类成分不和该氢氧化钠溶液发生反应，在所选最大吸收波长处非黄酮类成分不会有吸收。

3 结论

采用火焰光度法测定青钱柳中的K，用原子吸收分光光度法测定青钱柳中的Fe、Mn、Cu、Zn、Ca、Mg等，结果表明青钱柳中含有K、Fe、Mn、Cu、Zn、Ca、Mg等元素，其中Mg、Zn、Mn、Ca等元素含量较多。

本实验采用索式提取法提取青钱柳中的总黄酮，提取效果好，操作简单，不影响提取产物活性，具有较好的应用价值。结果表明，在提取液为80%乙醇，提取时间为2h的条件下，总黄酮的提取含量达到42.782mg·g-1。无论是乙醇提取液还是在水提液中，槲皮素等黄酮类化合物的含量都较高。从含量上看，水提取的黄酮含量约只有乙醇提取的一半。

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Extraction Process Optimization of Total Flavonoids in Cyclocarya Paliurus and Trace Element Analysis

DENG You-lin1, PENG Ji-sheng2, LI Fang1, ZHU Li-wei1, YU Li-min1, WANG Mei-chun1, YANG Pan-pan1,TANG Shi1
(1.College of Chemistry and Chemical Engineering, Jishou University, Jishou 416000, China; 2.Guzhang Spring Together National Food Development Limited Corporation, Guzhang 416300, China)

A extraction procedure for total favonoids from cyclocarya paliurus by soxhlet extraction, was studied. The infuence of extracting solution, solvent strength, extraction time and extraction degree on the total favonoids extraction rate was investigated. The results showed that the best factors were: ethanol concentration of 80%, the extraction time was 2h, extraction for 3 times. The content of 8 kinds of mineral elements in the extraction solution, such as potassium, phosphate, calcium, magnesium, iron, manganese, copper and zinc, were confrmed by absorption spectrophotometry.

cyclocarya paliurus; favonoids; trace element

R 284.2

A

1671-9905(2016)04-0001-04

国家自然基金资助项目（21462017）；林产化工工程湖南省重点实验室开放基金项目（JDZ201402）；吉首大学化学化工学院研究生专项科研课题；吉首大学湖南省研究生培养创新基地（2014KFXM06）

邓佑林（1990-），男，湖南衡阳人，吉首大学硕士研究生，主要从事天然产物化学、有机化学研究。电话：15200791307，

E-mail：461958538@qq.com

唐石（1979-），男，湖南衡阳人，吉首大学教授，硕士生导师，主要从事有机化学、天然产物化学研究

2016-02-26