武汉地区门诊皮肤软组织感染患者中甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌PVL基因携带及耐药性检测

刘小丽 王斌 江元山 梁建生 袁红 张丽华 周燕飞 许慧琼

430015武汉市疾病预防控制中心消毒与病媒生物防制所（刘小丽、王斌、梁建生、许慧琼），病原生物检测所（江元山）；武汉市第一医院护理部（袁红）；黄陂区人民医院医院感染管理科（张丽华）；武汉市第五医院医院感染管理科（周燕飞）

·论著·

武汉地区门诊皮肤软组织感染患者中甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌PVL基因携带及耐药性检测

刘小丽 王斌 江元山 梁建生 袁红 张丽华 周燕飞 许慧琼

430015武汉市疾病预防控制中心消毒与病媒生物防制所（刘小丽、王斌、梁建生、许慧琼），病原生物检测所（江元山）；武汉市第一医院护理部（袁红）；黄陂区人民医院医院感染管理科（张丽华）；武汉市第五医院医院感染管理科（周燕飞）

目的 探讨从武汉地区门诊皮肤软组织感染（SSTI）患者中分离的甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）携带杀白细胞毒素（PVL）基因及耐药特征。方法 收集2011—2013年在武汉市5所医疗机构门诊就诊SSTI患者中分离的182株MSSA，采用纸片扩散法进行药敏试验，多重PCR法检测mecA基因和PVL基因。结果 182株MSSA中有65株PVL阳性，阳性率为35.71%。不同病种PVL阳性率差异有统计学意义（χ2=49.76，P=0.00），其中疖/痈（7/7）、毛囊炎（3/3）、脓肿（55.53%，30/57）和脓疱疮（2/4）的检出率较高。PVL 阳性患者年龄［（35.40±19.31）岁］小于 PVL阴性患者［（43.21±20.75）岁］，差异有统计学意义（t=2.50，P=0.01）。在65株PVL阳性MSSA菌株中，耐药率居前3位的依次是氨苄西林（87.69%）、青霉素（53.85%）、红霉素（41.54%）。在117株PVL阴性MSSA菌株中，耐药率居前3位的依次是克林霉素（26.50%）、青霉素（20.51%）、氨苄西林（12.82%）。PVL阳性 MSSA 菌株对青霉素（χ2=21.19）、氨苄西林（χ2=97.97）、多西环素（χ2=11.61）、环丙沙星（χ2=8.07）、红霉素（χ2=25.04）、庆大霉素（χ2=10.86）的耐药率高于 PVL阴性 MSSA菌株，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 武汉地区门诊MSSA SSTI患者中，PVL阳性率较高，对大多数β内酰胺类抗菌药物耐药，经验治疗可选择氟氯西林、复方磺胺甲 唑片或多西环素。

软组织感染；金黄色葡萄球菌；微生物敏感性试验；杀白细胞毒素；PVL基因

金黄色葡萄球菌是一种主要人类致病菌，它可引起轻微的皮肤软组织感染（skin and soft-tissue infections，SSTI），亦可引起坏死性肺炎和中毒休克综合征等中毒相关性疾病。金黄色葡萄球菌引起SSTI和严重的深部感染多与菌株携带杀白细胞毒素（Panton-Valentine leukocidin，PVL）基因有关，甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（methicillin-sensitive Staphylococcusaureus，MSSA）和社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（community-acquired methicillinresistantStaphylococcus aureus，CA-MRSA）均可携带PVL基因，两者之间关系密切，PVL阳性MSSA是CA-MRSA的基因储菌库［1］。近年来研究发现，产PVL的MSSA引起的感染越来越多，甚至可以引起死亡［2］。本研究采集门诊SSTI患者标本，以期了解武汉地区门诊SSTI患者中MSSA携带PVL基因及与耐药性关系，为门诊SSTI患者的抗菌药物合理使用提供科学依据。

材料与方法

一、菌株来源及鉴定

选择2011—2013年在武汉市第一医院、武汉市第五医院、黄陂区人民医院、江汉区万松街社区卫生服务中心、江岸区西马街社区卫生服务中心皮肤科、外科门诊就诊SSTI患者，对需切开引流或病灶破溃患者进行采样，如果病灶没有破损且不需切开引流，则不予采样，经患者知情同意后，由门诊换药室护士以无菌棉拭子采集病灶深部的脓液或分泌物，共采集标本1 400份，同时填写研究小组专门设计的《医院门诊病人换药情况问卷调查表》。按照《全国临床检验操作规程》（第3版）所规定的方法分离培养和鉴定出金黄色葡萄球菌。MSSA的筛查用头孢西丁（30 μg/片）纸片扩散法，并以PCR检测MecA基因确定。质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC29213，购于中国药品生物制品检定所。

二、药敏试验

用纸片扩散法对金黄色葡萄球菌进行11种抗菌药物的药敏试验，根据美国临床与实验室标准化研究所（CLSI）相关检验标准与操作规范（2010版）进行操作和结果判定［3］，抗菌药物包括青霉素、头孢西丁、氨苄西林、复方磺胺甲 唑片、多西环素、环丙沙星、红霉素、克林霉素、庆大霉素、四环素、利福平，均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

三、基因检测

1.细菌DNA模板制备：挑取金黄色葡萄球菌分离株转入700 μl液体LB培养基中，37℃摇床150转/min振摇过夜培养，离心收集菌落，弃上清后加入 TE 缓冲液（pH 8.0）300 μl混悬，加入 1 g/L 葡萄球菌溶菌酶5 μl消化细菌细胞，37℃培养箱孵育2 h。参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书步骤提取细菌DNA，每个PCR反应液中加入1.5 μl细菌DNA洗脱液。

2.多重PCR鉴定PVL阳性MSSA分离株：采用 McClure 等［4］设计的引物（MecA310）和反应条件对金黄色葡萄球菌进行分子鉴定，检测mecA基因，引物上游 5′-GTAGAAATGACTGAACGTCCGATA A-3′，下游：5′-CCAATTCCACATTGTTTCGGTCTA A-3′（310 bp）。参照Jarraud等［5］设计的PVL引物和反应条件检测PVL基因，PVL上游：5′-ATCATTA GGTAAAATGTCTGGACATGATCCA-3′，PVL 下游：5′-GCATCAASTGTATTGGATAGCAAAAGC-3′（433bp）。若mecA阴性、PVL阳性，即判定为PVL阳性MSSA分离株；若mecA阴性、PVL阴性，则为PVL阴性MSSA分离株。见图1。

图1 PCR检测金黄色葡萄球菌携带PVL和mecA基因的电泳图16SrRNA（+）为金黄色葡萄球菌。M：100bpDNAladder；1～4：PVL（+）MSSA；5、8：PVL（-）MSSA；6、7、9：PVL（-）MRSA；10：空白对照

四、统计分析

使用WHO推荐的WHONET5.4软件进行药敏试验结果分析，同时用SPSS16.0进行数据统计分析，计量资料比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、一般情况

本研究共分离203株金黄色葡萄球菌，其中21株MRSA、182株MSSA。分离出MSSA的182例SSTI患者中，男 106例（58.24%），女 76例（41.76%），年龄11个月至91（40.42±2.05）岁。病种包括：脓肿57例（31.32%），甲沟炎47例（25.82%），外伤后化脓感染28例（15.38%），表浅皮肤感染18例（9.89%），疖/痈7例（3.85%），脓疱疮 4例（2.20%），脓性指头炎 4例（2.20%），毛囊炎 3例（1.65%），丹毒 3例（1.65%）和其他11例（6.04%）。

二、PVL基因检出情况

182株MSSA中有65株PVL阳性，阳性率为35.71%。PVL阳性SSTI患者年龄［（35.40±19.31）岁］小于 PVL阴性患者［（43.21±20.75）岁］，差异有统计学意义（t=2.50，P=0.01）。不同病种患者PVL阳性率差异有统计学意义（P<0.01），其中疖/痈、毛囊炎、脓肿和脓疱疮的检出率较高。不同性别患者PVL阳性率差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

三、PVL与MSSA的耐药性分析

65株PVL阳性MSSA中，耐药率居前3位的依次是氨苄西林（87.69%）、青霉素（53.85%）、红霉素（41.54%）。117株PVL阴性MSSA，耐药率居前3位的依次是克林霉素（26.50%）、青霉素（20.51%）、氨苄西林（12.82%）。PVL阳性MSSA对青霉素、氨苄西林、多西环素、环丙沙星、红霉素、庆大霉素的耐药率明显高于PVL阴性MSSA，尤其是对β内酰胺类抗菌药物耐药率明显上升，差异均有统计学意义。见表2。

表1 182例皮肤软组织感染患者中甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌PVL基因检出情况

讨 论

表2 PVL阳性与PVL阴性甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）对抗菌药物敏感性比较［株（%）］

PVL是一种能募集多形核细胞和单核细胞并激发其凋亡和裂解的穿孔外毒素蛋白［6］，PVL阳性MSSA不仅可引起轻微的SSTI，也可引起皮肤感染的爆发，严重者可引起死亡等［2，7］。MSSA 可通过噬菌体的转导作用获得PVL基因，然后通过转座子SCCmec基因变成携带 PVL 基因的 MRSA［8］。可见控制携带PVL基因的MSSA至关重要，如有“蜘蛛样咬伤”表现，有脓肿反复发作，β内酰胺类抗菌药物疗效差，存在CA-MRSA的危险因素，应该考虑CAMRSA或PVL阳性MSSA［9］。本研究结果显示，从门诊SSTI患者中分离的MSSA菌株中PVL基因阳性率为35.71%，PVL阳性患者年龄小于PVL阴性患者，疖/痈、毛囊炎、脓肿和脓疱疮的PVL检出率较高，与国内外MSSA的研究结果类似［10-11］，但普遍高于国内外报道MRSA中PVL阳性率（28.6%和26.1%）［12-13］。

本次研究显示，PVL阳性MSSA菌株对β内酰胺类抗菌药物和红霉素类耐药率较高，如氨苄西林（87.69%）、青霉素（53.85%）、红霉素（41.54%），但PVL阴性MSSA菌株对氨苄西林、青霉素和红霉素的耐药率仅为20.51%、12.82%和10.26%，因此在临床上应用时要慎重选择β内酰胺类和红霉素类抗菌药物来治疗疖/痈、毛囊炎和脓肿等SSTI，可选择半合成的耐青霉素酶青霉素，如氟氯西林［9］。

克林霉素有很好的组织穿透能力，英国社区MRSA感染的诊断与处理指南中克林霉素可用于治疗MSSA感染［9］。在欧洲，克林霉素是SSTI的唯一推荐用药［14］。而本研究结果显示，PVL阳性和阴性MSSA菌株对克林霉素的敏感率只有21.54%和30.77%，提示我国门诊MSSA SSTI患者应慎用克林霉素进行经验治疗。

美国感染病学会指南推荐复方磺胺甲 唑片或多西环素用于门诊SSTI患者经验治疗用药［15］。本研究发现，PVL阴性或阳性MSSA菌株对复方磺胺甲 唑片、多西环素、庆大霉素、利福平的敏感率都很高，但利福平单独应用易产生耐药性，因此利福平可以作为辅助药物与其他抗菌药物联用，以避免导致细菌耐药。

综上所述，武汉地区门诊MSSA SSTI患者中PVL阳性率较高，尤其疖/痈、毛囊炎、脓肿和脓疱疮患者的PVL检出率最高，PVL阳性MSSA的耐药性普遍高于PVL阴性MSSA，且对大多数β内酰胺类抗菌药物耐药率明显升高，经验治疗可选择氟氯西林、复方磺胺甲 唑片或多西环素。

志谢 感染项目组所有工作人员的辛勤付出，武汉市疾病预防控制中心熊燕主任、陈智副主任技师，江汉区万松街社区卫生服务中心杨志兵主任、江岸区西马街社区卫生服务中心夏志忠主任、江汉区疾病预防控制中心刘建龙科长、江岸区疾病预防控制中心丁晓红副主任、黄陂区疾病预防控制中心韩墨主任在项目实施过程中的支持与帮助

［1］RasigadeJP,LaurentF,LinaG,etal.Globaldistributionandevolution of Panton-Valentine leukocidin-positive methicillin-susceptible Staphylococcus aureus,1981-2007 ［J］.J Infect Dis,2010,201（10）:1589-1597.DOI:10.1086/652008.

［2］LowTB,HartyL,MurrayM,etal.PantonValentineleukocidinMSSA leadingtomulti-organfailure［J］.IrMedJ,2009,102（6）:185.

［3］Clinical and Laboratory Standards Institute.MS100-S20.Performance standards for antimicrobial susceptibility;Testing twenty informational supplement［S］.CLSI,2010.

［4］McClure JA,Conly JM,Lau V,et al.Novel multiplex PCR assay for detection of the staphylococcal virulence marker Panton-Valentine leukocidin genes and simultaneous discrimination of methicillin-susceptible from-resistant staphylococci ［J］.J Clin Microbiol,2006,44 （3）:1141-1144.DOI:10.1128/JCM.44.3.1141-1144.2006.

［5］Jarraud S,Mougel C,Thioulouse J,et al.Relationships between Staphylococcus aureusgenetic background,virulence factors,agr groups （alleles）,and human disease［J］.Infect Immun,2002,70（2）:631-641.DOI:10.1128/IAI.70.2.631-641.2002.

［6］Özekinci T,Dal T,Yanık K,et al.Panton-Valentine leukocidin in community and hospital-acquiredStaphylococcus aureusstrains［J］.Biotechnol Biotechnol Equip,2014,28（6）:1089-1094.DOI:10.1080/13102818.2014.976457.

［7］Bourigault C,Corvec S,Brulet V,et al.Outbreak of skin infections due to panton-Valentine leukocidin-positive methicillin-susceptible Staphylococcus aureusin a French prison in 2010-2011［J］.PLoS Curr,2014,6:PMC3946008.DOI:10.1371/currents.outbreaks.e4df88f057fc49e2560a235e0f8f9fea

［8］Boyle-Vavra S,Daum RS.Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus:the role of Panton-Valentine leukocidin［J］.Lab Invest,2007,87（1）:3-9.DOI:10.1038/labinvest.3700501.

［9］Nathwani D,Morgan M,Masterton RG,et al.Guidelines for UK practice for the diagnosis and management of methicillin-resistant Staphylococcus aureus （MRSA） infections presenting in the community［J］.J Antimicrob Chemother,2008,61（5）:976-994.DOI:10.1093/jac/dkn096.

［10］赵春江,王辉,刘颖梅,等.北京四家医院社区获得性甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌感染的流行病学调查［J］.中华检验医学杂 志,2012,35 （3）:237-242.DOI:10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2012.03.010.Zhao CJ,Wang H,Sun QN,et al.Epidemiological investigation of community-acquired methicillin resistantStaphylococcus aureus infection from 4 hospitals in Beijing［J］.Chin J Lab Med,2012,35（3）:237-242.DOI:10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2012.03.010.

［11］Kaltsas A,Guh A,Mediavilla JR,et al.Frequency of pantonvalentine leukocidin-producing methicillin-sensitive Staphylococcus strainsin patients with complicated skin and soft tissue infection in Bronx,New York ［J］.J Clin Microbiol,2011,49（8）:2992-2995.DOI:10.1128/JCM.00704-11.

［12］Shrestha B,Singh W,Raj VS,et al.High prevalence of Panton-Valentine leukocidin （PVL） genes in nosocomial-acquired Staphylococcus aureusisolated from tertiary care hospitals in Nepal［J］.BiomedResInt,2014,2014:790350.DOI:10.1155/2014/790350.

［13］胡龙华,熊建球,周信云,等.儿童与成人金黄色葡萄球菌分离株携带PVL基因状况比较［J］.临床儿科杂志,2012,30（3）:251-255.DOI:10.3969/j.issn.1000-3606.2012.03.015.Hu LH,XiongJQ,Zhou XY,etal.Thecomparison of Staphylococcus aureuscarrying Panton-Valentine leukocidin gene between children′s isolates and adult isolates［J］.J Clin Pediatr,2012,30（3）:251-255.DOI:10.3969/j.issn.1000-3606.2012.03.015.

［14］De Angelis G,Cipriani M,Cauda R,et al.Treatment of skin and soft tissue infections due to community-associated methicillinresistant Staphylococcus aureus in Europe: the role of trimethoprim-sulfamethoxazole0010［J］.Clin Infect Dis,2011,52（12）:1471-1472.DOI:10.1093/cid/cir247.

［15］Liu C,Bayer A,Cosgrove SE,et al.Clinical practice guidelines by the infectious diseases society of america for the treatmentof methicillin-resistantStaphylococcus aureusinfections in adults and children［J］.Clin Infect Dis,2011,52（3）:e18-e55.DOI:10.1093/cid/ciq146.

Prevalence of Panton-Valentine leukocidin genes and antimicrobic resistance inStaphylococcus aureusisolates from outpatients with skin and soft-tissue infections in Wuhan city

Liu Xiaoli,Wang Bin,Jiang Yuanshan,Liang Jiansheng,Yuan Hong,Zhang Lihua,Zhou Yanfei,Xu Huiqiong

Department of Disinfection and Pest Control,Wuhan Centers For Disease Prevention and Control,Wuhan 430015,China（Liu XL,Wang B,Liang JS,Xu HQ）;Institute of Pathogen Detection,Wuhan Centers For Disease Prevention and Control,Wuhan 430015,China（Jiang YS）;Department of Nursing,Wuhan No.1 Hospital,Wuhan 430022,China（Yuan H）;Department of Hospital Infection Management,Huangpi People′s Hospital,Wuhan 430300,China （Zhang LH）;Department of Hospital Infection Management,Wuhan Fifth Hospital,Wuhan 430050,China（Zhou YF）

Objective ToestimatetheprevalenceofPanton-Valentineleukocidin（PVL）genesandantimicrobial resistance in methicillin-sensitiveStaphylococcus aureus（MSSA）isolateds from outpatients with skin and soft-tissue infections （SSTIs）in Wuhan city.Methods A total of 182 MSSA isolates were collected from outpatients with SSTIs in 5 different hospitals in Wuhan city between 2011 and 2013.The Kirby-Bauer′s disk diffusion method was used to evaluate antimicrobial susceptibility of the MSSA isolates,and multiplex PCR was performed to detect mecA and PVL genes in these isolates.Results Of the 182 MSSA isolates,65（35.71%）carried PVL genes.The positive rate of PVL genes was significantly different among patients with different diseases （χ2=49.76,P=0.00）,and relatively higher in patients with furuncles/carbuncles（7/7）,folliculitis（3/3）,abscesses（55.53%,30/57）or impetigo（2/4）.The age of patients with PVL-positive MSSA infection was significantly younger than that with PVL-negative MSSA infection（35.40±19.31 years vs.43.21±20.75years,t=2.50,P=0.01）.Among65PVL-positiveMSSAisolates,therateofresistancetoclindamycinwashighest（87.69%）,followedbythattopenicillin（53.85%）anderythromycin（41.54%）.Thefrequencyofresistancetoclindamycinwas highestin117PVL-negativeMSSAisolates,followedbythattopenicillin（20.51%）andampicillin（12.82%）.Furthermore,there was a significantincrease in the rate of resistance to penicillin（χ2=21.19）,ampicillin（χ2=97.97）,doxycycline（χ2=11.61）,ciprofloxacin（χ2=8.07）,erythromycin（χ2=25.04）and gentamicin（χ2=10.86）in PVL-positive MSSA isolates compared with PVL-negative MSSA isolates（allP＜0.05）.Conclusions MSSA isolates from outpatients with SSTIs in Wuhan city are resistant to most β-lactam antibiotics.Flucloxacillin,compound sulfamethoxazole tablets or doxycycline is recommended for empirical treatment of PVL-positive MSSA infections.

Soft tissue infections;Staphylococcus aureus;Microbial sensitivity tests;Panton-Valentine leukocidin;PVL genes

Liang Jiansheng,Email:wh-ljs@sohu.com

梁建生，Email:wh-ljs@sohu.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.03.005

武汉市卫生局公共卫生科研项目（WG12D03）

Fund program:Public Health Research Program of Wuhan Municipal Health Bureau（WG12D03）

2015-08-12）

（本文编辑：周良佳 颜艳）