系统性红斑狼疮患者STAT3表达水平及其与DNA甲基化相关性研究

朱小华 梁俊 杨永生 徐金华

200040上海，复旦大学附属华山医院皮肤科

系统性红斑狼疮患者STAT3表达水平及其与DNA甲基化相关性研究

朱小华 梁俊 杨永生 徐金华

200040上海，复旦大学附属华山医院皮肤科

目的 探讨系统性红斑狼疮（SLE）患者外周血T淋巴细胞DNA甲基化水平、信号传导与转录激活因子3（STAT3）基因表达水平及二者的相关性。方法 取34例SLE患者和23例健康对照者外周血，分离T淋巴细胞，采用5甲基胞嘧啶抗体与流式细胞仪检测DNA甲基化状态，用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）分析STAT3 mRNA表达水平。结果 SLE活动期患者17例DNA甲基化水平（8.50±1.42）显著低于健康对照者（11.31±1.34，P＜0.01），而其 STAT3基因表达水平（1.34±0.32）显著高于健康对照者（1.02±0.28，P＜0.01）。SLE缓解期患者17例DNA甲基化水平（11.30±1.34）及STAT3基因表达水平（1.01±0.27）与健康对照组相比，差异无统计学意义（均P＞0.05）。SLE活动期患者DNA甲基化水平显著低于缓解期（P＜0.01），而其STAT3基因表达水平显著高于缓解期（P＜0.01）。Pearson相关分析显示，SLE患者DNA甲基化水平与SLE疾病活动指数（SLE-DAI）呈负相关（r=-0.78，P＜0.01），STAT3基因表达水平与 SLE-DAI呈正相关（r=0.50，P＜0.01），而STAT3基因表达水平与DNA甲基化水平无相关（r=-0.13，P＞0.05）。结论 STAT3在外周血T淋巴细胞中的异常表达与SLE的病情活动相关。STAT3基因表达水平与DNA甲基化水平无相关性。

红斑狼疮，系统性；DNA甲基化；STAT3转录因子

系统性红斑狼疮（SLE）是累及全身多器官的慢性进行性病谱性自身免疫病。表观遗传学研究显示，DNA低甲基化通过促进CD11a/CD18、CD70等共刺激分子的表达，使T细胞具有自身反应性，活化的T细胞可促使B细胞活化、分泌免疫球蛋白，产生大量的针对自身抗原的抗体［1-2］。目前对于SLE中DNA甲基化异常的形成和调控机制尚不十分清楚，涉及甲基化调控因素的研究很少。信号传导与转录激活因子3（STAT3）在细胞内起着重要的信号传递作用，负责将细胞外的信号传递到细胞核，通过诱导靶基因转录发挥生物刺激的效应作用［3］。本研究探讨STAT3在SLE发病中的作用及与DNA甲基化的相关性。

材料与方法

1.材料：淋巴细胞分离液（国药集团化学试剂有限公司），CD3免疫磁珠分离器（德国Mitenyi Biotec公司），5甲基胞嘧啶抗体（美国Aviva Systems Biology公司），FITC标记的羊抗鼠二抗（美国Santa Cruz公司），RNA抽提试剂盒（美国Promega公司），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2.临床病例收集：SLE患者34例，男4例，女30例，年龄 18～51（33.2±9.6）岁，为门诊和住院患者，诊断标准依据1997年美国风湿病学会修订的SLE标准，并根据SLE疾病活动指数（SLE-DAI）进行评分。其中活动期17例，诊断依据颊部红斑等典型的临床表现、抗核抗体等异常的实验室指标及SLE-DAI≥5；缓解期患者17例，诊断依据SLE病史，实验室指标及SLE-DAI＜5。健康对照组23例，男2例，女21例，年龄19～51（33.4±9.3）岁。

3.淋巴细胞的分离：采集SLE患者和健康对照者外周血10 ml，采用Ficoll密度梯度离心法，再采用CD3免疫磁珠按免疫磁珠及分离柱的说明书分离T淋巴细胞。将分离的细胞分成2份，分别用于DNA甲基化检测与STAT3的表达分析。

4.DNA甲基化检测：采用5甲基胞嘧啶抗体与流式细胞仪检测DNA甲基化状态［4］，具体过程如下：将分离的一份外周血T淋巴细胞，在离心管中调整细胞为106/ml。PBS清洗1次，4%甲醛PBS室温固定20 min后，PBS清洗3次；含0.5%Triton-100的PBS通透化处理15 min，PBS清洗3次；含10%羊血清的PBS封闭60 min后，用5甲基胞嘧啶抗体（终浓度为1 mg/L）37℃下孵育30 min，再用含0.1%吐温20的PBS室温下清洗3次；用铝箔包裹后在室温下用FITC标记的羊抗鼠二抗孵育60 min以上，用含0.1%吐温20的PBS清洗3次。在流式细胞仪中检测平均荧光强度，设立不加5甲基胞嘧啶抗体的阳性对照，DNA甲基化水平=（样品荧光强度－阳性对照荧光强度）/阳性对照荧光强度。

5.STAT3基因表达水平检测：将分离的T淋巴细胞用Trizol法提取总RNA，反转录为cDNA。RTPCR扩增STAT3与内参照β肌动蛋白。引物序列：STAT3 正向引物：5′-CGACCTGCAGCAATACCATTG A-3′，反向引物：5′-ACTCCATGTCAAAGGTGAGGG A-3′，共 135 bp；β 肌动蛋白正向引物：5′-GCACCA CACCTTCTACAATGAGC-3′，反向引物：5′-GGATA GCACAGCC TGGATAGCAAC-3′，共 156 bp。PCR 反应条件：94℃预变性 5 min；94℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，50个循环；95℃保温 1 min。制作熔点曲线，确定扩增产物的特异性。每个样品目的基因的Ct值用内参基因的平均Ct值来进行归一化（△Ct目标=Ct目标-Ct内参），分别获得病例组和对照组样品目的基因的△Ct值，然后计算出目的基因的相对表达量即 2-△△Ct。

6.统计学处理：采用Excel软件记录与整理数据，使用Stata7.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示，采用方差分析比较多组间总体差异，组内多重比较时采用Bonferroni校正法，相关性分析采用Pearson相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.SLE患者与健康对照组DNA甲基化水平比较：SLE活动期患者、缓解期患者及健康对照组DNA甲基化水平分别为8.50±1.42、11.30±1.34和11.31±1.34，3组间差异有统计学意义（F=25.18，P＜0.01）。两两多重比较结果显示，SLE活动期显著低于缓解期及健康对照组（均P＜0.01），而SLE缓解期与健康对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.SLE患者与健康对照组STAT3基因的表达：SLE活动期患者、缓解期患者及健康对照组STAT3基因表达水平分别为1.34±0.32、1.01±0.27和1.02±0.28，3组间差异有统计学意义（F=7.66，P＜0.01）。两两多重比较结果显示，SLE活动期患者组显著高于缓解期组和健康对照者（均P＜0.01），而SLE缓解期组与健康对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。STAT3基因表达曲线图见图1。

3.SLE患者DNA甲基化水平、STAT3基因表达水平与SLE-DAI的相关性分析：Pearson相关分析显示，SLE患者DNA甲基化水平与SLE-DAI成负相关（r=-0.78，P＜0.01），见图 2。STAT3基因表达水平与 SLE-DAI呈正相关（r=0.50，P＜0.01），见图3。而STAT3基因表达水平与DNA甲基化水平无明显相关性（r=-0.13，P＞0.05）。

图1 STAT3的曲线图

图2 SLE患者DNA甲基化水平与SLE-DAI的相关性

图3 SLE患者STAT3的表达水平与SLE-DAI的相关性

讨 论

人类基因组中约有70%组织特异表达的基因5′端上游区有富含CpG二核苷酸对的CpG岛。CpG岛的甲基化及其去除的状态，对维持和调节相关基因的表达起重要作用，当某些CpG岛的甲基化去除，可引起细胞相关基因的表达异常，从而引至各种疾病的发生［5-6］。研究［6-8］表明，表观遗传学变化与几类疾病的发病机制有关，主要包括癌症、免疫缺陷病及自身免疫性疾病。

本研究结果显示，SLE患者体内DNA甲基化水平显著降低，且DNA甲基化水平与SLE-DAI呈负相关，说明表观遗传学的改变可能是SLE发病的重要机制。目前有研究［1，9］证实，DNA 低甲基化通过促进LFA-1、CD70等共刺激分子的表达，使T细胞具有自身反应性，活化的T细胞一方面促使B细胞活化、分泌免疫球蛋白；另一方面，大量杀伤巨噬细胞，增加血液循环中的自身抗原，降低了对免疫复合物的清除，两者相互促进，产生了大量针对自身抗原的抗体。

STAT3是一个重要的信号转导调节因子，与免疫、炎症以及细胞增殖、分化、存活和凋亡等有关［3］。STAT3 可刺激 T 细胞分泌 IL-10［10］，并在 Th17/Th1平衡通路中起调控作用［11］。STAT3在肾小球中的激活可导致增生性免疫复合物性肾小球肾炎［12］。免疫组化［13］显示，狼疮模型小鼠的系膜细胞中STAT3被激活，引起系膜细胞增殖，进而参与狼疮肾炎的发生发展。本文结果显示，SLE活动期患者STAT3基因表达水平高于健康对照组，且STAT3基因表达水平与SLE-DAI呈正相关，说明STAT3基因在外周血T淋巴细胞中的异常表达可能与SLE的发病有关。

STAT3基因参与DNA甲基化的调控，研究发现，用STAT3 siRNA处理恶性T淋巴细胞后DNA甲基转移酶1（DNMT1）的表达明显下降，导致DNA低甲基化［14］。但本研究中，SLE患者STAT3基因的表达水平与DNA甲基化水平没有明显的相关性，STAT3在SLE表观遗传学发病机制的作用有待进一步研究。

［1］Jeffries MA,Sawalha AH.Epigenetics in systemic lupus erythematosus：leading the way for specific therapeutic agents［J］.Int J Clin Rheumtol,2011,6（4）：423-439.DOI：10.2217/ijr.11.32.

［2］Miceli-Richard C.Epigenetics and lupus［J］.Joint Bone Spine,2015,82（2）：90-93.DOI：10.1016/j.jbspin.2014.03.004.

［3］Murray PJ.The JAK-STAT signaling pathway：input and output integration［J］.J Immunol,2007,178（5）：2623-2629.DOI：10.4049/jimmunol.178.5.2623.

［4］朱小华,李锋,陈国梁,等.SLE患者基因组DNA甲基化水平的检测［J］.中华皮肤科杂志,2009,42（10）：705-707.DOI：10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2009.10.018.Zhu XH,Li F,Chen GL,et al.DNA methylation in peripheral blood mononulclear cells from patients with systemic lupus erythematosus［J］.Chin J Dermatol,2009,42（10）：705-707.DOI：10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2009.10.018.

［5］Chang C,Gershwin ME.Drugs and autoimmunity：a contemporary review and mechanistic approach［J］.J Autoimmun,2010,34（3）：J266-275.DOI：10.1016/j.jaut.2009.11.012.

［6］Jeffries MA,Sawalha AH.Autoimmune disease in the epigenetic era：how has epigenetics changed our understanding of disease and how can we expect the field to evolve?［J］.Expert Rev Clin Immunol,2015,11 （1）：45-58.DOI：10.1586/1744666X.2015.994507.

［7］Gupta B,Hawkins RD.Epigenomics of autoimmune diseases［J］.Immunol Cell Biol,2015,93（3）：271-276.DOI：10.1038/icb.2015.18.

［8］Delsante G,Fietta P.Epigenetics in autoimmune connective tissue diseases［J］.Acta Biomed,2014,85（2）：91-107.

［9］Lee HS,Bae SC.Recent advances in systemic lupus erythematosus genetics in an Asian population［J］.Int J Rheum Dis,2015,18（2）：192-199.DOI：10.1111/1756-185X.12498.

［10］Hedrich CM,Rauen T,Apostolidis SA,et al.Stat3 promotes IL-10 expression in lupus T cells through trans-activation and chromatin remodeling［J］.Proc Natl Acad Sci U S A,2014,111（37）：13457-13462.DOI：10.1073/pnas.1408023111.

［11］Prado C,de Paz B,Gómez J,et al.Glucocorticoids enhance Th17/Th1 imbalance and signal transducer and activator of transcription 3 expression in systemic lupus erythematosus patients［J］.Rheumatology （Oxford）,2011,50 （10）：1794-1801.DOI：10.1093/rheumatology/ker227.

［12］Zhang W,Chen X,Shi S,et al.Expression and activation of STAT3 in chronic proliferative immune complex glomerulonephritis and the effect of fosinopril［J］.Nephrol Dial Transplant,2005,20（5）：892-901.DOI：10.1093/ndt/gfh652.

［13］杨荟,徐安平,吕军,等.信号传导和转录激活因子3及其蛋白抑制剂在狼疮小鼠肾组织中的表达［J］.南方医科大学学报,2012,32（6）：821-825.DOI：10.3969/j.issn.1673-4254.2012.06.014.Yang H,Xu AP,Lyu J,et al.Expression of stat3 and pias3 in renal tissues of mrl/lpr mice［J］.J South Med Univ,2012,32（6）：821-825.DOI：10.3969/j.issn.1673-4254.2012.06.014.

［14］Zhang Q,Wang HY,Woetmann A,et al.STAT3 induces transcription of the DNA methyltransferase 1 gene （DNMT1） in malignant T lymphocytes［J］.Blood,2006,108 （3）：1058-1064.DOI：10.1182/blood-2005-08-007377.

STAT3 expression and its relationship with DNA methylation in patients with systemic lupus erythematosus

Zhu Xiaohua,Liang Jun,Yang Yongsheng,Xu Jinhua
Department of Dermatology,Huashan Hospital,Fudan University,Shanghai 200040,China

ObjectiveTo investigate DNA methylation status as well as signal transducer and activator of transcription 3 （STAT3） gene expression in peripheral blood T-lymphocytes from patients with systemic lupus erythematosus （SLE）,and to explore their relationship.MethodsPeripheral blood samples were obtained from 34 patients with SLE and 23 healthy controls followed by the isolation of T-lymphocytes.Flow cytometry was performed to evaluate DNA methylation status using antibodies against 5-methylcytosine （5-mc）,reverse transcription （RT）-PCR to detect the mRNA expression of STAT3 in T-lymphocytes.ResultsCompared with healthy controls,17 patients with active SLE showed significantly decreased DNA methylation levels（8.50±1.42 vs.11.31±1.34,P＜0.01）,but increased STAT3 mRNA expression levels（1.34±0.32 vs.1.02±0.28,P＜0.01）.However,there were no significant differences between 17 patients with stable SLE and healthy controls in DNA methylation levels（11.30±1.34 vs.11.31±1.34,P＞0.05）or STAT3 mRNA expression levels（1.01±0.27 vs.1.02±0.28,P＞0.05）.Patients with active SLE also showed significantly reduced DNA methylation levels,but enhanced STAT3 mRNA expression compared with those with stable SLE （bothP＜0.01）.As Pearson correlation analysis showed,SLE disease activity index （SLE-DAI）was negatively correlated with DNA methylation levels in patients with SLE （r=－0.78,P＜0.01）,but positively correlated with STAT3 mRNA expression （r=0.50,P＜0.01）,and no significant correlation was observed between STAT3 mRNA expression and DNA methylation levels（r=－0.13,P＞0.05）.ConclusionThe aberrant expression of STAT3 in peripheral blood T-lymphocytes may be related to disease activity in SLE,but unrelated to DNA methylation levels.

Lupus erythematosus,systemic;DNA methylation;STAT3 transcription factor

Xu Jinhua,Email：hsyyxjh@163.com

2015-04-13）

（本文编辑：周良佳 颜艳）

徐金华，Email：hsyyxjh@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.02.007

国家自然科学基金（81371745）；上海市自然科学基金（12ZR1404500）

Fund programs：National Natural Science Foundation of China（81371745）;Shanghai Natural Science Foundation（12ZR1404500）