DNA 甲基化在调节干细胞成骨分化中的作用

申玉 杨璞 郝晋 经典 唐舸 赵志河

口腔疾病研究国家重点实验室 华西口腔医院正畸科（四川大学），成都 610041

·综述·

DNA 甲基化在调节干细胞成骨分化中的作用

申玉 杨璞 郝晋 经典 唐舸 赵志河

口腔疾病研究国家重点实验室 华西口腔医院正畸科（四川大学），成都 610041

DNA甲基化和去甲基化是表观遗传学的重要机制之一，在细胞分化、增殖、衰老等方面具有重要的调控作用。干细胞在成骨分化过程中成骨特异性基因发生去甲基化进而表达上调，而与干细胞多能分化潜能相关的基因发生高甲基化进而表达抑制。DNA甲基化和去甲基化的动态变化和平衡，对于协调基因表达的时序性和抑制不和谐的分化表型具有重要作用，是干细胞成骨分化的重要保证。成骨分化中甲基化修饰机制的异常不仅会影响干细胞的正常成骨分化功能，并且与多种骨骼常见疾病的发生发展具有密切的关系。本文综述了干细胞成骨分化过程中受DNA甲基化修饰调控的相关基因和调控机制的新进展，以及DNA甲基化修饰异常可能导致的骨骼疾病。

DNA甲基化； DNA去甲基化； 成骨分化； 表观遗传学

表观遗传学是指在没有改变细胞核内DNA序列的情况下，发生的基因表达的可逆的、可遗传的变化，其中包括DNA甲基化、组蛋白甲基化、组蛋白乙酰化、微小RNA（microRNA，miRNA）和非编码长链RNA等。DNA甲基化是表观遗传学调控的重要机制之一，是一种由DNA甲基化转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）介导的，将具有活性的甲基转移至胞嘧啶-鸟嘌呤（CpG）双核苷酸中胞嘧啶的C5位点上的酶促反应[1]。目前普遍认为，DNA序列的高甲基化状态与基因表达的抑制相关联。DNA的去甲基化与DNA甲基化的作用相反，特定序列发生去甲基化引起的DNA甲基化程度降低，往往导致基因表达水平上升。然而近年发现，DNA甲基化程度与基因表达的反向调节关系并不绝对成立。DNA去甲基化参与多种细胞进程，但是对于DNA去甲基化的具体机制和通路仍有诸多争议[2]。

以往对于DNA甲基化修饰的研究[3]多集中于胚胎干细胞，DNA甲基化修饰对于胚胎干细胞的自我更新能力、多向分化能力和衰老等都具有至关重要的作用；而DNA甲基化修饰对成体干细胞的功能影响，尤其是细胞分化的影响，目前尚未完全明确，属于研究的热点问题。DNA的甲基化和去甲基化具有时间性和空间性，在增强子和启动子区域的甲基化修饰的动态变化可调控有序的基因表达。干细胞的正常分化不仅需要通过DNA甲基化等机制沉默多余基因、抑制不和谐的分化表型的出现，更需要DNA去甲基化等机制来促进组织特异性基因的选择性表达。DNA的甲基化修饰出现异常，不仅影响细胞的正常分化功能，更与疾病的发生发展以及治疗策略密切相关。多种骨骼疾病的发生，包括骨质疏松和骨关节炎等，都与干细胞成骨分化的DNA甲基化修饰机制出现障碍密切相关[4]。研究表观遗传学在干细胞成骨分化中的作用机制不仅有利于阐明相关骨骼疾病的发生机制，更有利于骨再生相关的组织工程学的发展。本文将综述近年来对于DNA甲基化修饰的新进展，以及DNA甲基化修饰在干细胞成骨分化过程中的调控机制。

1 DNA甲基化和去甲基化调控基因表达的基本机制

DNA甲基化由DNMTs催化发生。根据反应中参与的酶的不同以及反应过程的差异，DNA甲基化可以分为从头甲基化和维持甲基化。在DNA的半保留复制过程中，只有亲代链是甲基化的，维持甲基化酶DNMT1催化新合成的DNA链进行甲基化修饰，这个过程称为维持甲基化。从头甲基化是指不依赖于已有的甲基化DNA链，而在一个新位点将DNA链中胞嘧啶C5位点甲基化，由从头甲基化酶DNMT3a 和DNMT3b催化发生。然而，有研究[5]采用DNMTs基因靶向抑制与全基因组测绘的方法，进一步分析每种DNMTs的功能特异性，发现DNMT1与DNMT3a/ 3b的功能存在部分重叠，从头甲基化酶DNMT3a/3b也具有一定的维持甲基化酶的作用。实验[5]证实，DNMT3a/3b在DNA去甲基化的早期被招募，提示DNMT3a/3b还可能参与了去甲基化的过程。此外，DNA甲基化酶还包括两种特殊的类型：DNMT3L和DNMT2。DNMT2具有相对较低的催化活性，缺失DNMT2后不会对全基因组的甲基化状态和细胞分化表型有明显影响。DNMT3L本身不具有催化DNA甲基化的活性，但它可以与DNMT3a或者DNMT3b相结合，不仅可以促进DNMT3a或者DNMT3b的催化活性，而且可以增加DNMT3a或者DNMT3b对于DNA链的亲和性。除通过DNMT3L途径，还有学者[6]应用质谱分析的研究方法发现，即使没有DNMT3L的存在，DNMT3a与DNMT3b也可以在体内外直接结合形成复合物，相互促进催化活性。当DNMT3a与DNA结合后，组蛋白的H3尾部也参与调节DNMT3a的活化，组蛋白的H3尾部与DNMT3a的植物同源结构域（plant homeodomain，PHD）相结合，引起了DNMT3a的化学变构，从而活化DNMT3a[7]。

相对于DNA甲基化机制，关于DNA去甲基化的研究相对较少，但近年来越来越多地受到学者的关注。DNA去甲基化可分为主动去甲基化与被动去甲基化。在DNA半保留复制过程中，DNMT1的催化活性受到抑制，导致子链DNA的维持甲基化进程出现障碍，进而导致甲基化胞嘧啶的水平降低，该过程称为被动去甲基化。而主动去甲基化过程不依赖于DNA的复制过程，主要分为两种形式，其一是通过Ten eleven translocation（Tet）酶家族氧化C5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）转化为5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）[1]。另一种则是通过胞嘧啶脱氨基酶将甲基化修饰的胞嘧啶转化为腺嘌呤或者胸腺嘧啶，不配对的碱基被切除，导致去甲基化的发生[8]。2009年，Tahiliani等[9]证实小鼠胚胎干细胞中有5hmC的存在，并验证了Tet酶通过催化5mC转化为5hmC从而参与了表观遗传学的调控。其后许多研究陆续开始关注Tet蛋白家族对基因表达和细胞功能的影响。Tet蛋白为DNA甲基化的主要去除酶，它的氧化产物可作为去甲基化发生的中间产物被进一步清除，同时5hmC也可直接与转录因子结合，作为独立的表观遗传标志物发挥作用[10]。Tet蛋白家族包括Tet1、Tet2和Tet3，无论单独敲除还是联合敲除3种Tet蛋白基因，胚胎发育和干细胞分化都会出现不同程度的障碍，说明Tet蛋白酶对于正常的发育和分化具有至关重要的作用[5,10-12]。

虽然DNA的高甲基化普遍被认为与基因抑制相关联，但越来越多的研究发现这一关联并不绝对，DNA甲基化程度与基因表达的关系可能取决于序列中CpG的含量，发生甲基化修饰的位点等多种因素。大约70%的人类基因的启动子区域都拥有CpG密集的区域既CpG岛，可根据CpG比例、GC含量和CpG富集区域的长度，将启动子分为3个等级，即高CpG启动子（high-CpG promoters，HCPs）、低CpG启动子（low-CpG promoters，LCPs）和中等CpG启动子（intermediate-CpG promoters，ICPs）。HCPs即使在基因表达抑制时仍然处于低甲基化，而LCPs则一般处于高甲基化状态，ICPs相对特殊，它的甲基化可随着发育和分化出现动态变化，大多数的组织特异性甲基化都发生在ICPs。有研究[13]发现，dlx5基因的CpG岛岸区域而非CpG岛的甲基化水平降低，导致dlx5表达的上调，提示CpG岛岸区域也是调控基因表达差异的关键区域。近年来DNA甲基化修饰对于增强子区域的调控作用也开始逐渐引起关注和研究。增强子区域有含量较高的5hmC存在，而Tet家族参与了增强子区域的5hmC的动态变化[14]。另有研究[15]发现，DNMT1也与基因增强子区域的甲基化状态密切相关，增强子的正常甲基化状态受到干扰后出现基因表达时序上的错乱，从而引起分化的延迟。DNA甲基化可通过多种机制抑制基因的表达：甲基化的CpG可阻碍转录因子与DNA结合；通过改变染色质的构象间接介导转录抑制；甲基化的DNA位点还可结合转录抑制因子，如甲基CpG结合蛋白（methyl-CpG binding proteins，MBPs）等[16]。这种调节模式在多种细胞中被普遍证实但并不绝对，转录因子亦可与甲基化的序列进行交互作用，非启动子甲基化与组织特异性基因的转录也可成正相关[2]。

2 DNA甲基化和去甲基化调控成骨分化相关基因

在干细胞的成骨分化过程中，DNA甲基化和去甲基化通过上述基本机制参与调节多种相关基因的表达。干细胞向特定表型分化时，相应的组织特异性基因表达上调，并伴随着其他分化方向基因的沉默，从而抑制不和谐表型的表达，同时与干细胞多向分化能力相关的基因也发生下调，这对维护干细胞正常分化功能具有重要意义。具体到成骨分化过程中，DNA甲基化机制参与调控的成骨标志基因发生高表达，并与DNA序列发生去甲基化相一致[13,17-22]（表1），而干细胞多向分化潜能相关基因的表达发生抑制，并与相应基因启动子区域的甲基化程度升高相关联[23-25]（表2）。例如在脂肪间充质干细胞成骨诱导过程中，可以检测到成骨特异性基因Dlx5、Runx2、Bglap和Osterix的表达均发生上调，DNA甲基化测序进一步证实Dlx5、Runx2、Bglap和Osterix的促进子区域DNA甲基化水平发生明显下降，DNA的甲基化水平与其基因的表达呈明显的相关性；抑制DNA去甲基化酶的作用后，这些基因的表达随之发生逆转，由此可以推断：Dlx5、Runx2、Bglap和Osterix在脂肪间充质干细胞的成骨分化中主要受到DNA甲基化机制的调控[18]。与成骨特异性基因相反，同样在脂肪来源的间充质干细胞中，多能分化潜能相关基因NANOG的甲基化水平则随着成骨分化的发生而上调，伴随NANOG表达量明显下降[23]。

表 1 受DNA甲基化修饰调控的成骨分化标志基因Tab 1 Osteogenic differentiation marker gene regulated by DNA methylation modification

表 2 成骨分化中受DNA甲基化修饰调控的多能分化相关基因Tab 2 Multiple differentiation related genes regulated by DNA methylation in osteogenic differentiation

干细胞的成骨分化受到多种信号通路的调节，其中Wnt通路起到至关重要的作用。目前为止，在哺乳动物中至少发现了19个Wnt蛋白。Wnt通路中的关键信号分子亦受到DNA甲基化的调控，通过影响Wnt通路的信号转导，DNA甲基化间接调控干细胞的成骨向分化表型。受体酪氨酸激酶样孤核受体2（receptor tyrosine kinase like orphan receptor 2，Ror2）作为非经典Wnt信号通路的共受体，已被证明在经典和非经典的Wnt信号通路中均起到重要作用。Ror2在形态发育中不可或缺，特别是骨骼发育，可以通过诱导成骨转录因子Osterix而改变干细胞的分化表型，在向成骨细胞分化中Ror2表达不断增加，然后随着细胞分化为骨细胞而下调。Ror2启动子的去甲基化过程开始于骨髓间充质干细胞向成骨分化的第8天，并持续到第21天成骨分化完成[26]。另外，DNA甲基化修饰还参与调节Wnt5a和Wnt8a的表达，DNA甲基化调节机制异常可扰乱Wnt通路信号分子的转导，导致骨髓间充质干细胞成骨分化障碍[27-28]。

3 DNA的甲基化修饰与骨骼疾病

DNA甲基化参与调节多种成骨相关基因的表达，而这些调控机制出现异常则可能是导致相关骨骼疾病的发病机制之一。骨质疏松症和骨关节炎是常见的骨骼疾病。骨质疏松症表现为系统性的骨矿物质含量（bone mineral content，BMC）和骨矿物质密度（bone mineral density，BMD）降低，而骨关节炎患者则表现为关节周围的骨形成增加，还可能呈现普遍的骨量增高。骨质疏松所导致的骨密度和强度的改变，同样也表现在颌骨之中。牙槽骨的BMC 和BMD随着骨质疏松的进展而逐渐降低[29]。BMC和BMD的下降，是口腔常见的疾病——牙周炎的危险因子之一，与牙周疾病的严重程度之间存在明显的相关性[30]。除此之外，骨骼系统性疾病也间接影响到多种口腔诊疗技术的治疗效果。在骨质疏松模型中，正畸矫治力导致的牙齿移动速度明显加快，并且在正畸治疗结束后的复发概率较对照组增加[31]。通过动物模型研究[32]发现，骨质疏松症还影响种植体植入后的骨整合过程。因此，研究系统性骨骼疾病的发病机制具有重要的临床意义。

DNA甲基化机制可能是一些常见骨骼疾病的发病机制之一。García-Ibarbia等[27]将骨质疏松伴随髋部骨折患者的骨组织样品与骨关节炎患者相比较，结果发现，前者成骨细胞的Wnt信号通路的活性降低，并发现Wnt信号相关基因Fzd10、Tbl1x、Csnk1e、Wnt8A、Csnk1a1l、Sfrp4的甲基化状态存在差异，这可能有助于解释骨质疏松和骨关节炎的表观遗传学机制。另一项研究[13]利用DNA甲基化芯片技术检测了髋部骨关节炎和髋部骨质疏松骨折患者的骨样本，探讨全基因的DNA甲基化模式在两种疾病中的差异，结果显示，共有241个Cpg位点的甲基化状态出现明显的差异；生物信息学分析表明，差异的位点多与细胞成骨分化和骨骼胚胎发育相关，尤其是Homeobox家族基因。脊柱韧带骨化病（ossifications of the yellow ligaments，OYL）的病理学机制表现为脊柱韧带的异位骨化，间充质干细胞向成骨分化的趋势增加。有学者从OYL患者的脊柱韧带中分离出间充质干细胞，与具有正常分化能力的间充质干细胞进行全基因组的基因表达对比，结果发现，OYL的间充质干细胞中Wnt5A和胶质细胞源性神经营养因子（glial cell derived neurotrophic factor，GDNF）基因的表达量增高，并且伴随启动子区域明显的去甲基化改变。这些结果提示，OYL患者的间充质干细胞通过启动子的去甲基化修饰促进Wnt5A和GDNF基因的表达从而造成成骨分化亢进[28]。另外，长期服用类固醇激素可导致骨坏死，分离检测患者的间充质干细胞显示成骨分化趋势减弱；进一步研究表明，三磷酸腺苷结合盒蛋白B亚家族成员1基因的高甲基化状态可能与间充质干细胞分化趋势偏移有相关性[33]。

DNA甲基化和去甲基化的动态平衡是干细胞成骨分化的重要保证，DNA甲基化修饰的表观遗传学机制出现异常不仅会影响到干细胞成骨分化功能，而且与许多常见骨骼疾病的发生发展有密不可分的关系。因此，探究DNA甲基化修饰在成骨分化中的作用，不仅对于骨组织工程学具有重要的意义，而且可以为多种相关疾病的治疗提供可能的靶点。

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（本文编辑 吴爱华）

Role of DNA methylation in regulation of osteogenic differentiation of stem cells

Shen Yu, Yang Pu, Hao Jin, Jing Dian, Tang Ge, Zhao Zhihe.
(State Key Laboratory of Oral Diseases, Dept. of Orthodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

Supported by: National Natural Science Foundation of China (31470904); Science and Technology Project of Sichuan Province (2013SZ0057). Correspondence: Zhao Zhihe, E-mail: zhzhao@scu.edu.cn.

DNA methylation and demethylation are two important mechanisms of epigenetics, which is important in the study of cell differentiation, proliferation, and senescence. During osteogenic differentiation of stem cells, the expression of osteogenic specific genes and demethylated promoters is upregulated, whereas the expression of pluripotent genes and hypermethylated promoters is downregulated. The dynamic changes and balance between DNA methylation and demethylation are important for the coordination of gene expression and the inhibition of improper phenotypes. Abnormal changes in the methylation modification mechanism in osteogenic differentiation not only affect the normal function of stem cells but are also associated with the occurrence and development of many common skeletal diseases. This paper reviews the new progress of DNA methylation and demethylation in regulating osteogenic differentiation. The possible skeletal diseases caused by abnormal DNA methylation are also presented.

DNA methylation; DNA demethylation; osteogenic differentiation; epigenetics

Q 75

A [doi] 10.7518/hxkq.2016.05.019

2016-02-25；

2016-05-21

国家自然科学基金（31470904）；四川省科技计划（20-13SZ0057）

申玉，硕士，E-mail：dentistshenyu@foxmail.com

赵志河，教授，博士，E-mail：zhzhao@scu.edu.cn