实时荧光定量PCR检测CD44v8在膀胱及尿路上皮癌中的表达*

刘小荣，王永翔，赵立明，赵小东，刘学军，任玉林，李少君

(甘肃省第二人民医院：1.检验科；2.泌尿外科，兰州 730000)



·论著·

实时荧光定量PCR检测CD44v8在膀胱及尿路上皮癌中的表达*

刘小荣1，王永翔2△，赵立明2，赵小东2，刘学军2，任玉林2，李少君2

(甘肃省第二人民医院：1.检验科；2.泌尿外科，兰州 730000)

目的探讨CD44v8在膀胱及尿路上皮癌的临床诊断价值。方法收集实验组患者膀胱及尿路上皮癌患者75例，采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)从病理和临床分期2个方面对CD44v8进行定量分析。对照组20例患者为正常膀胱黏膜组织。结果CD44v8蛋白在对照组膀胱黏膜上皮无表达，拷贝数小于1×102拷贝/毫升。75例膀胱及尿路上皮癌患者阳性表达26例(34.7%)，CT值均小于35,基因拷贝数均大于1×104拷贝/毫升。阳性表达率与肿瘤病理分级、肿瘤分期(TNM)相关，与肿瘤复发和数量无相关性。结论CD44v8可作为判断膀胱及尿路上皮癌分级、分期的参考指标，具有临床诊断意义。

上皮癌；膀胱；尿路；实时荧光定量PCR；CD44v8蛋白

侵袭和转移是恶性肿瘤最本质的特征,其与很多因素相关，目前对恶性肿瘤各种因子的研究已成为热点[1]。CD44分子通过与细胞外基质中的透明质酸、胶原蛋白、血管内皮细胞等黏附，致使肿瘤细胞具有很强的生长及转移能力,在肿瘤的发生、发展中起重要的作用。近年来研究发现CD44与多种肿瘤的复发、浸润、转移有关[2-4]。本研究应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测CD44v8蛋白在膀胱及尿路上皮细胞癌中的表达，探讨CD44v8与膀胱尿路上皮细胞癌病理分级、临床分期、复发的相关性。

1　资料与方法

1.1一般资料75例膀胱尿路上皮细胞癌标本选自2010年1月至20014年6月该院泌尿外科手术切除且经病理确诊患者(实验组)，男59例，女16例，年龄28～86岁，平均年龄57岁。根据国际抗癌协会(UICC)制定的肿瘤分期(TNM)标准：Tis-a期14例，T1期25例，T2期21例，T3期10例，T4期5例；病理Ⅰ级27例，Ⅱ级25例，Ⅲ级23例；初发组51例，复发组24例；单发组51例，多发组24例。20例对照组患者膀胱尿路上皮细胞组织均取自经耻骨上前列腺摘除术，经病理证实为正常膀胱黏膜组织。

1.2仪器与试剂API7500实时荧光定量PCR 仪。核酸提取液B，逆转录酶，Taq酶系，CD44v8 PCRMIX,CD44v8阳性质控品，阴性质控品，均由北京索奥生物医药科技有限公司提供。

1.3方法(1)DNA提取：选取约50 mg膀胱黏膜组织转移至1.5 mL干净离心管中，加1 mL生理盐水混匀，研磨器研制成匀浆，12 000 r/min离心5 min，弃上清液，沉淀加50 μL核酸提取液(DNA)，充分混匀，100 ℃处理10 min，12 000 r/m离心5 min，取上清液4 μL做PCR反应。(2)PCR扩增：从试剂盒中取出CD44v8 PCR MIX、Taq酶系，室温融化并振荡混匀，10 000 r/min离心10 s。参考北京索奥生物医药科技试剂盒说明书提取膀胱尿路上皮癌患者总RNA,利用逆转录酶进行反转录，合成cDNA。以cDNA 为模板，进行PCR扩增。CD44v8引物序列上游为：5′-TGG ACT CCA GTC ATA GTA TAA CGC-3′；下游为：5′-GGT CCT GTC CTG TCC AAA TC-3′，测试反应体系配置为：CD44v8 PCR MIX 24 μL，逆转录酶4 μL，Taq酶系2 μL。向设定的N个PCR反应管中分别加入26 μL反应体系，向每管中加入处理后的样品或CD44 v8阳性定量标准品(使用前用阴性质控品梯度稀释10、100、1 000倍，记为1×106、1×105、1×104拷贝/毫升)和阴性质控品4 μL,10 000 r/min瞬时离心3 s。将各反应管放入定量PCR反应槽内，按对应顺序设置阴性质控品、阳性定量标准品及未知标本，并设置反应体系30 μL，样品名称，标记荧光基团种类(报告基团为FAM，淬灭基团为TAMRA)和循环条件：95 ℃ 30 s，然后95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。

1.4结果判读(1)标准曲线：r=0.99，阳性CT≤35,基因拷贝数为1×104拷贝/毫升。(2)各待测反应管曲线图：分别绘制TNM分期CD44v8蛋白荧光定量PCR曲线图；WHO病理分级CD44v8蛋白荧光定量PCR曲线图；临床分期CD44v8蛋白荧光定量PCR曲线图；肿瘤数量CD44v8蛋白荧光定量PCR曲线图，根据相关标准进行结果判断。

1.5统计学处理采用SPSS13．0统计软件进行数据分析，计量资料组间比较使用方差分析和t检验，两样本率的比较应用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　　果

2.1CD44v8在2组患者中的表达结果比较CD44v8蛋白在对照组正常膀胱及尿路上皮细胞中不表达，在实验组膀胱及尿路上皮癌的阳性表达26例，阳性率34.7%。

2.2CD44v8与实验组膀胱尿路上皮癌TNM分期的关系CD44v8蛋白阳性表达率随TNM分期增加而升高，Tis-a期3例(21.4%)，T1期7例(30.4%)，T2期8例(40.0%)，T3期5例(50.0%)，T4期3例(37.5%)，浅表性(Tis-a～T1)与浸润性(T2～T4)比较，差异有统计学意义(P<0．05)。见表1。

2.3CD44v8与实验组膀胱尿路上皮癌病理分级的关系CD44v8蛋白表达随病理分级增加而升高，Ⅰ级4例(14.8%)，Ⅱ级9例(36%)，Ⅲ级13例(56.5%)，高分化膀胱尿路上皮癌(Ⅰ级)与低分化膀胱尿路上皮癌(Ⅱ、Ⅲ级)比较，差异有统计学意义(P<0．05)。见表1。

2.4CD44v8与膀胱尿路上皮癌复发的关系CD44v8蛋白在51例原发性膀胱尿路上皮癌中17例表达(33%)，24例复发性膀胱尿路上皮癌中9例表达(37%)，两者比较差异无统计学意义(P>0．05)。见表1。

表1　　CD44v8蛋白表达与TNM分期、病理分级、复发及肿瘤数量的相关性

2.5CD44v8与膀胱尿路上皮癌数量的关系CD44v8蛋白在51例单发膀胱尿路上皮癌中18例表达(35.2%)，24例多发膀胱尿路上皮癌中8例表达(33%)，两者比较差异无统计学意义(P>0．05)。见表1。

3　讨　　论

大量研究表明，CD44及其变异体在肿瘤的发生和发展过程中起着重要的作用，与乳腺癌、结肠癌、肾癌、胆管癌、前列腺癌等多种肿瘤的生长、侵袭和转移有着密切的联系[5-6]。CD44是一种蛋白形式的细胞表面黏附因子，参与细胞-细胞、细胞-基质之间的特异性粘连过程，人类CD44基因位于11号染色体短臂上。目前已发现CD44mRNA至少由20个外显子组成,完整基因组在染色体上大约跨越50 kb[7-8]。CD44基因的外显子按表达方式分为2种：一种是组成型外显子,另一种是V区变异型外显子。组成型外显子共有10个,其转录片段存在于所有CD44转录子中,仅含组成型外显子的转录子称为标准型CD44(CD44s)[9]。V区变异型外显子也有10个,在基因组上位于第5和第6个组成型外显子之间,在染色体DNA上跨越25 kb。含有V区外显子的CD44转录子统称为拼接变异体(CD44V)。

近年来，众多学者通过基因水平、蛋白水平2个方面检测尿液中CD44，从而对膀胱肿瘤的分化、浸润、数量、转移、复发及预后作了大量的研究。目前关注较多的主要是CD44s、CD44v2、CD44v6、CD44v8～10对膀胱肿瘤的诊断。

通过对恶性肿瘤组织中各种CD44分子的检测结果表明，许多类型的肿瘤均有不同程度的CD44分子表达[10]。CD44s和CD44v的异常表达，与膀胱尿路上皮癌的发生、发展有着密切的联系，但目前仍未得出统一的结论。多数学者的研究结果显示，CD44s表达缺失同时伴有CD44v表达增高，与肿瘤分化程度较差、分期较晚显著相关。有关研究报道，同时检测组织和尿脱落细胞中CD44的表达，CD44v8～10与膀胱尿路上皮癌的进展相关，在浸润性膀胱尿路上皮癌患者的尿脱落细胞中升高[11-14]。本研究应用实时荧光定PCR方法检测正常膀胱黏膜及膀胱尿路上皮癌组织中CD44v8蛋白的表达，探讨CD44v8阳性表达与病理分级、临床分期、肿瘤数量及复发的关系，结果表明，阳性表达随膀胱尿路上皮癌的分级、分期增加而升高，但与膀胱尿路上皮癌的数量、复发无关。CD44v8蛋白可作为判断膀胱尿路上皮癌分化程度、临床分期的参考指标。

[1]王永翔，赵立明，赵小东，等．膀胱尿路上皮细胞癌CD44s和CD44v8蛋白的表达及临床意义[J]．临床泌尿外科杂志，2010，25(2)：116-119．

[2]王颖智，Yang CX,刘鷖雯，等．实时荧光定量PCR检测CD44和RHAMM在胃肠肿瘤中的表达研究[J]．检验医学，2008，23(4)：338-343．

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[5]盛亚琳．细胞粘附分子CD44与肿瘤关系的研究进展[J]．实用医技杂志，2008，15(7)：926-928．[6]周刚，邱大卫，秦大江，等．二重荧光定量RT-PCR检测胰腺癌患者CD44v6基因的表达[J]．国际检验医学杂志，2011，32(18)：2051-2054．

[7]Golshani R,Lopez L,Estrella V,et al.Hyaluronic acid synthase-1 expression regulates bladder cancer growth,invasion,and angiogenesis through CD44[J].Cancer Res,2008,68(2):483-491.

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The detection of the expression of CD44v8 with RT-PCR in bladder and urothelial carcinoma*

LIUXiaorong1,WANGYongxiang2△，ZHAOLiming2，ZHANXiaodong2，LIUXuejun2,RENYulin2,LIShaojun2

(1．DepartmentofClinicalLaboratory;2.DepartmentofUrology，theSecondPeople′sHospitalofGansuProvince，Lanzhou,Gansu730000，China)

ObjectiveTo explore the expression of CD44v8 protein in human bladder and urothelial carcinoma,as well as the value in diagnosis of human bladder and urothelial carcinoma.MethodsRT-PCR was used to analysis the expression of CD44v8 protein in 75 patients with bladder and urothelial carcinoma in the pathological stage and clinical stage and 20 subjects of normal bladder mucosa were collected as control.ResultsCD44v8 protein was negative in all normal bladder and urothelial mucosa,the copy number was less than 1×102copy/mL; 26 cases of bladder and urothelial carcinoma was positive,and the positive rate of CD44v8 was 34.7%,and Ct values were less than 35 and copy number was greater than 1×104copy/mL.Positive rate was correlated with high pathological grades and TNM stages，but no significant difference was observed in recurrence of tumor．ConclusionCD44v8 could be useful indicator for the assessment of pathological grades and TNM stages of bladder and urothelial carcinoma．

carcinoma;bladder;urothelial carcinoma;RT-PCR;CD44v8 protein

兰州市科技计划项目资助(2012-1-37)。

刘小荣，女，主管检验医师，主要从事病原微生物、免疫学研究。

，E-mail:gswyongxiang@126.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.19.011

A

1673-4130(2016)19-2687-03

2016-03-02

2016-05-24)