DNA三角双锥结构的放射性标记

李剑波, 王雪梅, 包宝亮, 何玉林, 王相成,张国建, 白　侠, 刘　磊

(内蒙古医科大学附属医院核医学科, 呼和浩特 010050)



DNA三角双锥结构的放射性标记

李剑波, 王雪梅, 包宝亮, 何玉林, 王相成,张国建, 白侠, 刘磊

(内蒙古医科大学附属医院核医学科, 呼和浩特 010050)

分别采用点击化学方法对DNA三角双锥结构进行氟-18标记研究, 采用二氯亚锡还原法对DNA三角双锥结构进行锝-99m标记研究. 结果表明， 点击化学方法不适用于DNA三角双锥结构的氟-18标记; 而采用二氯亚锡还原法则制得了以DNA三角双锥结构为载体的分子影像探针99mTc-DBNs.

DNA三角双锥结构; 放射性标记; 氟-18; 锝-99m

分子影像技术是一种实时影像技术, 它利用某个合适的探针可以无侵袭地研究受体表达状况, 从而在分子和细胞水平上对人体或者其它生命体中特定分子的信号进行检测[1]. 分子影像技术在临床上的应用有助于了解疾病的机制、 诊断疾病、 监测疾病的进展并提高治疗效果[2～4]. 近年来, 分子影像技术发展迅速, 涉及生物、 医学及药物研发等多个领域[5～7].

分子影像技术的发展不仅依靠于高性能的影像设备, 更对性能优良的分子影像探针提出了高要求[8,9]. DNA多面体结构具有纳米级结构, 其结构稳定、 易于合成、 生物相容性好且可以进行精确的修饰和定位. 因此, DNA多面体结构在分子影像、 药物载带及靶向治疗等方面受到关注[10～16]. 据文献[17]报道, DNA四面体结构载带siRNA在小鼠体内可实现基因沉默, 说明DNA四面体结构能够在动物模型体内实现一定的稳定性并产生生理作用, 但该方法所使用的荧光分子断层成像融合CT成像(FMT-CT)的分辨率和灵敏度都有较大限制.

本文使用放射性核素对DNA多面体结构进行标记, 制备了可用于PET或者SPECT显像的分子影像探针. 通过对DNA三角双锥结构(DBNs)进行氟-18和锝-99m标记研究, 以得到基于DNA三角双锥结构为载体的分子影像探针.

1　实验部分

1.1试剂与仪器

Agilent 1100型色谱仪(美国Agilent公司); Amicon超滤膜(切割分子量为300000, 美国Millipore公司); U-3010型紫外分光光度计(日本 Hitachi公司).

1.2实验过程

1.2.1DBNs的制备与纯化参照文献[18,19]方法, 由一步退火操作合成DBNs, 如Scheme 1所示. 将等摩尔的6条ssDNA(分别标记为a, b, c, A, B和C, 具体的单链序列信息参见表1)在TM缓冲液(10 mmol/L Tris-base, 5 mmol/L MgCl2, pH=8.0)中混合均匀, 于95 ℃孵育10 min后, 迅速降温至4 ℃后孵育20 min, 即得到DBNs.

Scheme 1　Self-assembly process of DBNs

ssDNAOligonucleotidesequenceaAGGCAGTTGAGACGAACATTCCTAAGTCTGAAATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCACCbCTTGCTACACGATTCAGACTTAGGAATGTTCGACATGCGAGGGTCCAATACCGACGATTACAGcGGTGATAAAACGTGTAGCAAGCTGTAATCGACGGGAAGAGCATGCCCATCCACTACTATGGCGACTGCGCGGATGACTCAACTGCCTGGTGATACGATCTAGTCTCTACGTCAAGTAAGAACCTTAGBCCTCGCATGACATCCGCGCAGCTAAGGTTCAAAGTTCCTGCCGCTTCACGGACGGTATTGGACCCTCTTCCCGACCGTGAAGCGGCAGGAACTTATACTTGACGTAGAGACTAGAAGGATGGGCATGT20-a∗TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTAAGTCTGAAATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCACCAGGCAGTTGAGACGAACATTCA20AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

利用体积排阻色谱法(SEC)对产物进行分离纯化. 高效液相色谱(HPLC)分析条件, Phenomenex BioSec-SEC-4000型色谱柱(300 mm×7.8 mm); 流动相:NaCl(450 mmol/L)+Tris-HCl(25 mmol/L, pH=7.3); 紫外检测波长260 nm; 等度洗脱; 流速0.6 mL/min.

带有侧臂链(T20)的DBNs由6条ssDNA(分别标记为T20-a*, b, c, A, B和C, 具体的单链序列信息参见表1)组成, 其制备和纯化过程与DBNs相同.

1.2.2DBNs的表征利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、 荧光共振能量转移(FRET)、 HPLC和原子力显微镜(AFM)对纯化后的DBNs进行了表征[19].

1.2.32-[18F]氟乙基叠氮的制备将18F-溶液富集在QMA柱上, 用1 mL Kryptofix 222和K2CO3混合溶液淋洗. 将得到的18F-溶液在95 ℃下用氮气吹干, 再加入500 μL无水乙腈共沸除水, 重复3次, 保证18F-尽可能处于无水环境.

2-[18F]氟乙基叠氮参考文献[20]方法制备. HPLC分析条件:Zorbax C18柱(250 mm×4.6 mm); 流动相A为水相[含三氟乙酸(体积分数0.1%)], 流动B为乙腈相[含三氟乙酸(体积分数0.1%)]; 紫外检测波长220 nm; 梯度条件:0～20 min, 95%A(体积分数)→50%A(体积分数); 流速1 mL/min.

1.2.4DBNs的氟-18标记在组成DBNs的6条ssDNA中任意选取一条进行炔基修饰, 然后将炔基修饰的ssDNA与其余5条ssDNA混合, 按照1.2.1节方法制备炔基修饰的DBNs, 再采用与DBNs相同的方法分离纯化得到炔基三角双锥结构(炔基-DBNs).

将一定量的炔基三角双锥溶液、 CuSO4溶液、 叔丁基三氯乙酰亚胺酯(TBTA)溶液和抗坏血酸钠溶液, 与200 μL [18F]FEA的乙腈溶液(约200 μCi)混匀后, 在一定的温度下进行振荡反应. 从浓度、 用量、 反应温度、 反应时间和振荡频率等方面研究最佳标记条件. 利用Radio-HPLC对标记反应过程进行实时检测和分析.

1.2.5MAG3-ssDNA的制备与纯化将250 μg ssDNA(A20)溶解于4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES, 0.3 mol/L, pH=8.0)溶液中, 再加入NHS-MAG3(300 μg), 使n(ssDNA)∶n(NHS-MAG3)=1∶20.将混合液在室温下孵育2 h后, 加入乙酸铵溶液(2 mol/L)终止反应. 将反应溶液通过NAP-5柱进行纯化, 以乙酸铵溶液(0.25 mol/L)为洗脱液, 收集纯化的MAG3-ssDNA(A20)溶液, 待用.

2　结果与讨论

2.1DBNs的制备与纯化

Fig.1　HPLC analysis of DBNs

参照文献[18,19]方法制备DBNs, 并利用HPLC对产物进行了纯化. DBNs色谱出峰时间在15～16 min之间(见图1). 将纯化后的DBNs溶液用Amicon超滤膜进行浓缩, 并利用紫外分光光度计测量, 将DBNs溶液浓度调整到合适的浓度备用. 通过PAGE, FRET, HPLC和AFM对产物进行了表征, 证明所得产物为DBNs[19].

2.2[18F]2-氟乙基叠氮的制备

向活化的18F-溶液中加入2-叠氮乙基对甲苯磺酸酯的无水乙腈溶液进行反应, 反应结束后由Radio-HPLC测得[18F]FEA的标记率达到95%以上.

2.3DBNs的氟-18标记

点击化学(Click chemistry)反应在Cu(Ⅰ)的催化下能够显著提高叠氮化合物和端炔修饰化合物的反应速率. 本文采用点击化学方法对炔基修饰的DBNs进行氟-18标记.

考虑到反应温度过低不利于标记反应, 故起始反应温度设定在25 ℃. 随着温度的升高, DBNs结构会出现一定量的破坏, 故选择相对温和的温度(25 ℃).

随着振动频率的加快, DNA三角双锥结构会出现一定量的破坏, 实验将振动频率设定在500 r/min.

利用点击化学方法对炔基三角双锥结构进行氟-18标记, 反应体系中含有Cu2+, TBTA保护剂和抗坏血酸钠溶液. 以炔基三角双锥结构的摩尔量为基准, 其余的化合物按照与炔基三角双锥结构的摩尔比进行添加反应, 结果如表2所示.

Table 2　Amount of each compound in the click reaction*

* Reaction conditions:200 μL [18F]FEA(200 μCi), 25 ℃, reaction frequency 500 r/min.

首先按照Cu2+离子与炔基三角双锥结构摩尔比为2∶1进行反应(表2中Entry 1), 反应30 min后取样检测, 发现DNA三角双锥结构被破坏. 考虑到Cu2+离子对DNA结构的破坏作用, 逐步降低Cu2+离子的含量, 同时提高TBTA保护剂的含量(表2中Entries 2～4). 反应开始后, 分别于30和60 min取样进行HPLC检测, 发现DNA三角双锥结构破坏依然严重, 同时由于Cu2+离子未能等摩尔浓度添加, 导致炔基三角双锥结构的Click反应不成功.

为了保证炔基三角双锥结构的稳定性, 实验中维持低浓度Cu2+离子, 同时加大TBTA保护剂和抗坏血酸钠的含量(表2中Entry 5), 反应开始后分别于30, 60和90 min取样进行HPLC检测, 发现反应30和60 min时结构稳定, 但是未标记成功; 而90 min时结构破坏严重, 仍然未能标记成功. 结果显示, DNA三角双锥结构在解链后有部分链被标记上, 但是结构本身已经不完整.

利用点击化学方法对炔基修饰的DNA三角双锥结构进行氟-18标记. 结果表明, 反应中标记效果不理想, 炔基三角双锥结构在标记过程中结构破坏严重.

2.4DBNs的锝-99m标记

DBNs的锝-99m标记流程如Scheme 2所示.

Scheme 2　Schematic diagram of radiolabeling DBNs with technetium-99m

Fig.2　HPLC analysis of 99mTc-DBNs(A) Radioactive detector; (B) UV detector.

参照文献[19]方法, 将MAG3配体基团偶联在ssDNA(A20)上, 得到MAG3-ssDNA(A20); 随后使用二氯亚锡还原法对MAG3-ssDNA(A20)进行锝-99m标记, 再将锝-99m标记的A20单链与含有T20手臂链的DBNs进行杂交, 标记反应的时间通常约为30 min, 利用Radio-HPLC进行分析放化产率, 反应标记率在90%以上, 产物放化纯度大于90%. 如图2所示, 锝-99m标记DNA三角双锥结构(99mTc-DBNs)的放射性信号的保留时间为13.8 min. 可见, 利用锝-99m对DNA三角双锥结构进行标记, 制得了99mTc-DBNs分子探针.

3　结　　论

研究了DNA三角双锥结构的氟-18和锝-99m的标记方法, 实验结果表明, 点击化学方法不适用于DNA三角双锥结构的氟-18标记; 而通过二氯亚锡还原法制得了99mTc-DBNs分子探针, 发展了一类以DNA多面体结构为载体的分子影像探针.

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(Ed.:P, H, D, K)

† Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81360227) and the Natural Science Foundation of Inner Mongolia, China[No.2015BS(LH)0803].

Radiolabeling of DNA Bipyramid Nanostructures†

LI Jianbo*, WANG Xuemei, BAO Baoliang, HE Yulin, WANG Xiangcheng,ZHANG Guojian, BAI Xia, LIU Lei

(Department of Nuclear Medicine, Inner Mongolia Medical University Affiliated Hospital, Hohhot 010050, China)

DNA bipyramid nanostructures were radiolabeled with fluorine-18 through click chemistry. Reactant concentration, catalyst dosage, reaction time, temperatureand reaction frequency in the CuAAC reaction were studied. DNA bipyramid nanostructures were also radiolabeled with technetium-99m through stannous chloride lableling method. The results showed that it was not a good idea to radiolabel DNA bipyramid nanostructures with fluorine-18 through click chemistry. At the same time99mTc-DBNs were successfully prepared. Radioactive molecular imaging probes would be obtained based on the nanoplatforms of DNA bipyramid nanostructures.

DNA bipyramid nanostructure; Radiolabeling; Fluorine-18; Technetium-99m

10.7503/cjcu20160407

2016-06-06. 网络出版日期:2016-08-23.

国家自然科学基金(批准号:81360227)和内蒙古自治区自然科学基金[批准号:2015BS(LH)0803]资助.

O621.3

A

联系人简介:李剑波, 男, 博士, 助理研究员, 主要从事分子影像探针方面的研究. E-mail:lijianbo_1235@163.com