新疆产桑属植物HPLC指纹图谱研究

杨 璐， 范少丽， 程 平， 李 宏

新疆林业科学院，新疆乌鲁木齐 830054)



新疆产桑属植物HPLC指纹图谱研究

杨 璐， 范少丽， 程 平， 李 宏*

新疆林业科学院，新疆乌鲁木齐 830054)

[目的]采用HPLC建立新疆产桑属植物指纹图谱。[方法]采用SunFire C18(4.6 mm×150.0 mm，5.0 μm)色谱柱；以甲醇-0.2%磷酸为流动相进行梯度洗脱，检测波长330 nm，流速0.8 mL/ min，柱温25℃，进样体积10 μL。[结果]对13批新疆不同来源的桑葚、桑叶进行检测，结果表明，建立的桑葚、桑叶指纹图谱精密度、稳定性和重复性良好。[结论]桑葚、桑叶HPLC指纹图谱可作为新疆桑属植物鉴别与质量控制的科学依据。

新疆；桑属植物；指纹图谱；高效液相色谱

桑属(MorusLinn.)植物是桑科多年生落叶乔木或灌木，新疆作为古丝绸之路的重要通道，拥有丰富的桑树资源[1]。桑属植物是重要的药用植物资源，其根皮、茎、果实和叶子均可入药，其果实(桑葚)具有补血滋阴、生津润燥的功效[2]，其叶(桑叶)具有疏散风热、清肺润燥、清肝明目的功效[3]。现代药理研究表明，桑葚与桑叶均具有抗氧化[4-5]、降血糖[6]、降血脂[7-8]等药理活性。指纹图谱是国内外广泛采用的一种药材质量评价模式，而HPLC指纹图谱具有分离效能高、分析速度快等优点[9-10]。研究者对广西、陕西等地产桑葚、

桑叶药材的指纹图谱进行研究[11-13]，但对于新疆产桑葚、桑叶的指纹图谱系统研究鲜见报道[14]。笔者采用高效液相色谱法，建立新疆产桑葚、桑叶的指纹图谱，并对不同来源的13批新疆产桑葚、桑叶HPLC色谱图进行分析，以期为更好地评价新疆桑属植物的综合质量提供参考。1材料与方法

1.1试验材料桑葚(鲜果)、桑叶(干燥叶)采自新疆吐鲁番地区，共采集13批桑葚、桑叶样品(表1)，采集时间为2015年5月。

表1　桑葚、桑叶样品来源

1.2试剂对照品：芸香叶苷(批号：C10027472，上海麦恪林生化科技有限公司，含量≥98%)；桑色素(批号：C10031384，上海麦恪林生化科技有限公司，含量≥98%)；甲醇(色谱纯，Fisher Scientific)；磷酸(分析纯，天津市致远化学试剂有限公司)；水为超纯水。

1.3仪器高效液相色谱仪(美国Waters，Alliance E2695，包括自动进样器、Empower色谱工作站等)；紫外检测器(美国Waters，Alliance 2998)，数控超声清洗器(KQ-300DE，昆山市超声仪器有限公司)。

1.4色谱条件色谱柱：SunFire C18(4.6 mm×150.0 mm，5.0 μm)；流动相：甲醇-0.2%磷酸；检测波长：330 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。梯度洗脱程序见表2。

表2　梯度洗脱程序

1.5供试品溶液制备精密称取桑葚(鲜果匀浆0.50 g)、桑叶(干燥粉末1.00 g)样品，分别加入10 mL 70%的甲醇超声提取30 min，5 000 r/min离心10 min，取上清液全量，氮吹，再定容至2 mL，用0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

1.6混合对照品溶液制备分别精密称定芸香叶苷、桑色素对照品，各加甲醇制成对照品浓度分别为0.600、0.400、0.200、0.100、0.060、0.010、0.002 mg/mL的混合对照品溶液，再用0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得混合对照品溶液。0.4 mg/mL的混合对照品溶液色谱见图1。

注：1.芸香叶苷；2.桑色素。Note: 1.Rutin hydrate; 2.Morin hydrate. 图1　混合对照品的HPLC色谱 Fig.1　HPLC chromatogram of mixed reference substances

2　结果与分析

2.1方法学考察

2.1.1精密度。取同一批次的样品(亚亚长黑1号)，按“1.5”供试品溶液的制备方法处理后，在已确定的HPLC色谱条件下连续进样6次，记录图谱，考察主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性，结果各色谱峰的相对保留时间RSD在0.01%～0.02%；各峰相对峰面积RSD在0.2%～1.2%。应用相似度软件对色谱峰进行自动匹配，结果表明，各指纹图谱的相似度均等于1。表明仪器的精密度良好，符合指纹图谱的检测要求。

2.1.2重复性。取同一批次的样品(亚亚长黑1号)，按“1.5”供试品溶液的制备方法处理后，平行6份，在已确定的色谱条件下进行检测，记录图谱，考察试验方法的重复性。结果表明，6 份样品中各色谱峰的相对保留时间RSD在0.01%～0.02%，共有峰相对峰面积RSD在1.2%～0.2%，应用相似度软件对色谱峰进行自动匹配，结果表明，各指纹图谱的相似度均大于0.999，符合指纹图谱的检测要求。

2.1.3稳定性。取同一批次的样品(亚亚长黑1号)，按“1.5”供试品溶液的制备方法制备一份供试品，在已确定的色谱条件下分别在 0、 2、 4、 8、16、 24 h 进行检测，记录图谱，考察样品溶液的稳定性。结果各色谱峰的相对保留时间RSD在0.03%～0.08%，各峰相对峰面积RSD在0.2%～0.8%，应用相似度软件对色谱峰进行自动匹配，结果表明，各指纹图谱的相似度均大于0.9。表明样品在24 h内稳定，符合指纹图谱的检测要求。

图2　5批黑桑HPLC指纹图谱Fig.2　HPLC fingerprint overlapping of 5 batches of black mulberry

图3　7批白桑HPLC指纹图谱Fig.3　HPLC fingerprint overlapping of 7 batches of white mulberry

图4　13批桑叶HPLC指纹图谱Fig.4　HPLC fingerprint overlapping of 13 batches of mulberry leaves

2.2指纹图谱的建立2.2.1共有峰的确定。精密称定13批桑葚、桑叶样品，分别按“1.5”方法制备供试品溶液，按“1.4”色谱条件分析，记录色谱图，桑葚、桑叶样品HPLC图谱见图2～4。采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004A版)》，以均值法生成指纹图谱共有模式，生成的对照指纹图谱R1、R2、R3见图5～7。按照峰面积的大小，13批桑叶样品共标示出9个共有峰，5批黑桑样品共标示出5个共有峰，7批白桑样品则标示出2个共有峰。经对照品保留时间定位及色谱峰紫外光谱分析，鉴别出2个共有峰。图5的峰2、图6的峰2与图7的峰5为芸香叶苷，图5的峰5与图7的峰8则为桑色素。

注：2.芸香叶苷；5.桑色素。Note: 2.Rutin hydrate; 5.Morin hydrate图5　5批黑桑HPLC特征指纹图谱的共有模式R1Fig.5　Common pattern R1 of HPLC fingerprints of 5 batches of black mulberry

图6　7批白桑HPLC特征指纹图谱的共有模式R2Fig.6　Common pattern R2 of HPLC fingerprints of 7 batches of white mulberry

注：5.芸香叶苷；8.桑色素。Note: 5.Rutin hydrate; 8.Morin hydrate.图7　13批桑叶HPLC特征指纹图谱的共有模式R3Fig.7　Common pattern R3 of HPLC fingerprints of 13 batches of mulberry leaves

2.2.2各共有峰相对保留时间与相对峰面积的测定。由HPLC色谱图可以看出，芸香叶苷是13批桑葚、桑叶共有的主要药效成分。选择图5的峰2、图6的峰2与图7的峰5(芸香叶苷)作为参照峰，分别计算各指纹图谱共有峰的相对保留时间与相对峰面积。结果13批桑叶样品各共有峰的相对保留时间RSD在0.01%～0.30%，各峰相对峰面积RSD在0.204%～0.839%。5批黑桑样品各共有峰的相对保留时间RSD在0.02%～0.04%，各峰相对峰面积RSD在49.22%～100.51%。7批白桑样品各共有峰的相对保留时间RSD为0.02%，相对峰面积RSD为19.55%。13批桑葚、桑叶样品的芸香叶苷含量见表3。由表3可知，各批样品之间共有指纹峰的相对保留时间具有较好的重现性，但各桑葚、桑叶样品中共有指纹峰的相对峰面积与芸香叶苷含量均有很大差异。

表3　样品中芸香叶苷含量

2.2.3相似度分析。通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004A版)》将13批桑叶、5批黑桑与7批白桑样品色谱图与相应的对照指纹图谱进行相似度分析，结果表明，桑叶样品S1～S13与对照指纹图谱R的相似度均大于0.900(表4)，符合指纹图谱的要求，可建立共有模式。但桑葚色谱图与对照指纹图谱有一定差异，可见桑葚品种与种植环境对桑葚质量的控制有重要影响。

表4　样品HPLC指纹图谱与对照指纹图谱R的相似度

3　讨论

3.1色谱条件的优化该试验对不同提取溶剂(体积分数分别为60%、70%、80%、100%甲醇)的超声提取效果进行比较，结果表明，以70%甲醇提取效果较优。孙莲等[15]、谭振鹏[16]研究表明，桑叶指纹图谱的检测波长为芦丁的最大吸收波长280 nm。该试验对供试品进行全波长扫描，结果表明，在330 nm处检测的峰数目较多，多数峰响应值较大，因此，选择330 nm作为桑葚、桑叶HPLC指纹图谱的检测波长。为了保证色谱图能从总体上反映桑葚的化学信息，各化学成分尽可能出峰，并达到基线分离，有良好的分离度，不断优化流动相的比例[17]，最终确定色谱条件，可实现图谱各峰较好分离，出峰时间适宜，峰形正态分布。

3.2共有峰的标定指纹图谱共有峰的标定，按照《重要注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》，根据13批供试品的检测结果，采用相对保留时间标定指纹共有峰，色谱峰的相对保留时间根据参照峰的保留时间计算[18]。该研究借助《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004A版)》自动匹配色谱图相关参数，13批桑叶样品共标示出9个共有峰，5批黑桑样品共标示出5个共有峰，7批白桑样品则标示出2个共有峰，避免人工判断的盲目性与误差。

从该试验得出的指纹图谱可看出，对于不同批次的新疆桑叶，共有指纹峰数量较多，其相对保留时间一致，且HPLC色谱图谱相似；相似度均较高(﹥0.900)，说明不同来源、批次桑叶的质量相对较稳定。7批白桑HPLC色谱图相似度有一定差异，可以反映不同批次白桑样品的内在质量差别。5批黑桑HPLC指纹图谱中，各批次样品间共有指纹峰的相对保留时间比较吻合，但不同批次的部分峰面积比值差别很大。

芸香叶苷为桑葚及其有关制剂的主要药效成分，在桑葚药品开发过程中，芸香叶苷为其制剂的主要质量控制标准[19]。该试验结果表明，芸香叶苷含量由高到低依次为桑叶、黑桑、白桑，尤其是桑葚样品，不同果实颜色的桑葚样品，芸香叶苷含量具有明显差异，推测这也是新疆黑桑药用价值高于白桑的原因之一[20]。该试验样品是于相近时间在新疆吐鲁番不同种植区采收的样品，且采收后使用统一前处理方法和保存条件，故认为品种因素与种植环境造成样品中各组分含量比例差异，在以后的研究中，将进一步累积样品，着重考虑品种因素的影响深入研究。该研究建立的HPLC指纹图谱方法精密度、稳定性、重复性良好，可为评价新疆桑葚、桑叶质量提供方法依据，争取优选出新疆产药效含量高的优质桑属植物品种，实现新疆桑属植物的规范化种植以保持其产品质量的稳定。

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Study on Fingerprints ofMorusalbafrom Xinjiang by HPLC

YANG Lu,FAN Shao-li,CHENG Ping,LI Hong*

Xinjiang Academy of Forestry Sciences,Urumqi,Xinjiang 830054)

[Objective] To establish the fingerprints ofMorusalba. from Xinjiang by HPLC.[Methods] The samples were separated on SunFire C18 (4.6 mm×150.0 mm,5.0 μm) with methanol-0.2% phosphoric acid as the mobile phase to conduct gradient eluent at the flow rate of 0.8 mL/min at 30 ℃,and the detection wavelength was 330 nm.The sample injection was 10 μL.[Results] 13 samples of mulberry and mulberry leaves from different origins of Xinjiang were detected.The results showed that the fingerprints had good accuracy,repeatability and stability.[Conclusion] The HPLC fingerprints can be used as the scientific evidence for identification and quality control ofM.albafrom Xinjiang.

Xinjiang;Morusalba; Fingerprint; HPLC

自治区公益性科研院所基本科研业务经费资助项目(KY201521)。

杨璐(1985- )，女，新疆乌鲁木齐人,助理研究员，硕士，从事植物资源化学与生物活性物质研究。*通讯作者，研究员，博士，从事林果栽培和综合利用研究。

2016-07-20

S 188

A

0517-6611(2016)26-0111-04