基于ISSR标记的新疆伊犁薰衣草品种资源的遗传多样性分析

郭丹丽，李 敏，王自健，蒋新明，黄先忠，路 喆，王 朴

(1．新疆生产建设兵团第四师农业科学研究所，新疆伊宁　835000;2．石河子大学生命科学学院植物基因组学实验室，新疆石河子　832003)



基于ISSR标记的新疆伊犁薰衣草品种资源的遗传多样性分析

郭丹丽1，李 敏1，王自健1，蒋新明1，黄先忠2，路 喆1，王 朴1

(1．新疆生产建设兵团第四师农业科学研究所，新疆伊宁835000;2．石河子大学生命科学学院植物基因组学实验室，新疆石河子832003)

【目的】揭示不同薰衣草品种的遗传多样性。【方法】利用ISSR分子标记技术对45个薰衣草品种的亲缘关系进行分析。【结果】45份材料DNA共扩增出83条谱带，平均每条引物扩增出9.2条带，多态性为60条带，多态性比例为72.29%。45份薰衣草品种两两之间的遗传距离值在0.663～0.988。群体的有效等位基因数(Ne)、基因多样度(H)、Shannon信息指数(I)分别为1.399 5、0.240 4和0.364 3。45个薰衣草品种在遗传距离0.72处可分为两类，第Ⅰ类包含44个品种，第Ⅱ类仅有1个品种。【结论】伊犁地区的45个薰衣草品种遗传多样性水平低，亲缘关系较近。

伊犁薰衣草；ISSR标记；聚类分析；遗传多样性分析

0　引言

【研究意义】薰衣草是一种具有多种经济价值、观赏价值、药用价值的香料作物[1-3]。自1964年伊犁地区从法国引种栽培薰衣草后，经过50多年的引种、驯化、选育及应用推广，薰衣草已成为伊犁地区的经济特色支柱产业[4]。目前，伊犁地区的薰衣草品种多、命名杂乱，仅利用植物形态学标记已无法准确地区别薰衣草品种。而我国对薰衣草种质资源的分子遗传学研究还不完善，因此利用分子标记技术深入研究伊犁地区的薰衣草种质资源，对充分发掘优异的品种资源、科学选用杂交亲本、提高作物育种效率等具有十分重要的意义。【前人研究进展】传统的薰衣草分类方法主要通过植物学形态分类方法进行分类，自20世纪40年代后，科学家通过染色体数目对薰衣草进行分类，这两种鉴定方法比较繁琐、工作量较大并且可靠性较差[5]。1980年后，DNA多态性的遗传标记产生后，被广泛应用于种质资源鉴定和遗传多样性分析等研究领域[6-7]。近年来，利用分子标记技术对薰衣草种质资源分析方面也进行了部分研究，如张艳玲等[8]利用RAPD标记技术对10个薰衣草品种进行了遗传多样性研究，发现这10个品种具有较高的遗传多样性；苏秀娟等[9]对新疆的19种薰衣草品种进行了种质资源遗传关系分析，发现这些薰衣草品种的遗传相似度较高。【本研究切入点】了解新疆伊犁地区薰衣草品种的遗传多样性及亲缘关系，研究利用ISSR标记方法，对第四师农科所薰衣草种质资源圃及65团第四师农科所试验基地的种质资源进行分析。研究薰衣草遗传多样性的文章比较少，目前，只有3人利用分子技术对薰衣草进行种质资源分析。【拟解决的关键问题】了解新疆伊犁地区薰衣草品种的亲缘关系，为研究不同品种之间的遗传差异分析其遗传背景为薰衣草的遗传改良奠定基础。

1　材料与方法

1.1材 料

研究所有材料来自新疆兵团第四师农科所特色资源苗圃收集种植的薰衣草品种，以及第四师农科所65团试验基地栽培的薰衣草品种。

1.2方 法

1.2.1薰衣草基因组DNA的提取

参照任艳利等[10]的方法提取薰衣草幼叶DNA，提取的薰衣草基因组DNA经紫外分光光度计法和琼脂糖凝胶电泳检测其质量与浓度，并将DNA稀释至50 ng/μL，样品于-20℃冷藏备用。

1.2.2 ISSR-PCR反应体系

查阅相关文献资料[9]，确定最佳反应体系为20 μL: 50 ng模板DNA, 0.4 mM dNTP, 3 mM MgCl2, 0.4 μM ISSR分子标记引物，1 UTaqDNA聚合酶。PCR反应程序为：94℃进行预变性4 min后，94℃变性45 s, 48℃(48～53℃)退火45 s, 72℃延伸45 s，共35个循环；72℃延伸8 min，最后4℃进行保存。

1.2.3ISSR扩增产物的检测

PCR反应结束后，扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测。电泳条件为：上样7 μL, 1×TAE缓冲液，100 V的电压35 min。电泳完毕后在凝胶成像系统上观察并采集图像，实验重复3次。

1.3数据统计

统计ISSR电泳的多态性条带，有条带的记为1，无条带的记为0。只有清晰和可重复的条带才可以记录。使用PopGene32软件计算有效等位基因数(Ne)、Nei’s基因多样性指数(H)、Shannon信息指数(I)、多态位点百分率(PPB)，用NTSYS-pc2.1分析软件计算相似系数(GS)，然后用非加权配对算术平均法(UPGMA)并进行聚类分析，绘制树状聚类图。

2　结果与分析

2.1ISSR引物扩增产物的多态性

9条ISSR引物对供试材料的DNA模板进行PCR扩增，并对扩增条带进行统计分析。结果表明，9条引物共获得83个扩增位点，其中多态性位点60个；每个引物扩增出的位点为5～14个，平均9.2个；每个引物扩增出的多态性位点2～14个，平均6.6个，多态性比率为72.29%。这表明供试薰衣草种质资源间存在较大的遗传变异，并且ISSR标记能够有效的揭示材料间的遗传多态性。图1,表1

M: DL 2000 Marker; 1-23: 23个不同的薰衣草品种

M: DL 2000 Marker; 1-23: 23 lavandula varieties

图1引物UBC808部分薰衣草品种扩增结果
Fig.1The part of ISSR amplification result using primer UBC808 of lavandula
表1ISSR引物扩增结果及多态性
Table 1Amplification result and polymorphic of 9 ISSR primers used in this study

引物Primer引物序列Primersequence退火温度Annealingtemperature(℃)扩增条带数No.ofbands多态性条带数No.ofpolymorphicbands多态性百分率(%)PercentageofpolymorphicbandsUBC808(AG)8C529666.7UBC818(CA)8G485480UBC826(AC)8C53131076.9UBC841(GA)8YC50131184.6UBC844(CT)8RC505240UBC845(CT)8RG495480UBC855(AC)8YT501414100UBC868(GAA)64910660UBC873(GACA)4499333.3总计Total836072.29平均Average9.26.7

注：表中R代表A或T，Y代表C或G

Note：R represents A/G/T and Y represents C/G

2.2ISSR标记的遗传多样性

通过POPGENE软件分析发现45份薰衣草材料之间的多态性位点百分率为72.29%，有效等位基因数(Ne)为1.399 5，Nei’s基因多样性指数(H)和Shannon信息指数(I)分别是0.240 4和0.364 3。通过NTSYS2.1软件计算不同薰衣草材料间的遗传相似性系数(GS值)，最后得到供试材料的相似性矩阵。遗传相似系数越大，暗示着亲缘关系越近；遗传相似系数越小，暗示着亲缘关系越远。45份薰衣草材料的相似性系数在0.663～0.988，变幅为0.325。其中，薰衣草材料YXD-5和YXD-6的二者之间的遗传相似性系数(0.988)最大，表明YXD-5和YXD-6的亲缘关系较近，遗传差异最小；材料YXB-2和YXD-10的遗传相似系数(0.663)最小，表明YXB-2和YXD-10的亲缘关系较远，遗传差异最大，存在较高的遗传多样性。

2.3ISSR标记聚类分析

根据遗传相似系数矩阵，选用UPGMA法进行聚类分析。聚类结果显示，遗传相似性系数为0.72时，所有薰衣草材料可分为两大类，第一大类(Ⅰ)含有44个材料品种，而第二大类(Ⅱ)则只有YXB-2，说明YXB-2和其他的薰衣草材料之间差异较大。当遗传相似性系数为0.79时，第一大类(Ⅰ)薰衣草品种又被分为2个亚类，即新薰4号、YXA-6、新薰2号、新薰1号、YXC-6以及YXD-8为一个亚类，剩余的38个品种被分为另一个亚类。这暗示着，在伊犁地区种植的薰衣草遗传关系比较近。图2

3　讨 论

遗传多样性直接反应了生物的遗传背景、作物育种潜力及其使用价值，只有认清了不同物种间的遗传变异信息和亲缘关系，才能有目的地选择亲本，选育优良品种。目前，利用ISSR技术在植物中进行遗传多样性分析、亲缘关系鉴定等方面的研究报道较多，结果表明，ISSR分子标记能够准确区分不同物种间的亲缘关系，是一种非常灵敏、有效的工具[11]。试验中9条ISSR引物在45份薰衣草材料中共产生83条扩增带，其中72.29%的扩增片段都能够揭示材料间的遗传差异，表明薰衣草品种间遗传相似性系数和遗传距离变化范围比较大，具有丰富的遗传基础。这一研究在国内其他对薰衣草种质遗传多样性的研究中都得到验证，这些分子标记都能产生多态性条带，但不同的分子标记的检测水平及多态性水平各不相同。如张艳玲等[8]利用RAPD标记对10个国外薰衣草材料进行亲缘关系进行分析，15个多态性引物共扩增出312条普带，其中99.38%具有多态性；苏秀娟等[9]等根据ISSR对新疆19份薰衣草品种进行了种质资源分析，9条ISSR引物共检测出94条带，其中42.6%为多态性条带。这些差异可能是由于材料选择和研究方法的不同造成的。

图2基于ISSR标记的45份薰衣草资源聚类
Fig.2Dendrogram of cluster analysis based on ISSR of 45 lavandula germplasm

实验同文献[9]的研究方法相同，都是用相同的9条ISSR引物对伊犁地区薰衣草进行扩增，但在扩增过程中引物所用的退火温度、扩增条带数与文献[9]的均不相同，可能与薰衣草材料、提取方法、实验仪器以及统计方法的差异不同所引起的。研究表明伊犁地区种植的薰衣草材料之间的遗传相似性系数在0.663～0.988，遗传多样性较低；而文献[9]做出的薰衣草遗传相似性系数为0.325～0.975，遗传多样性较高，这就表明薰衣草的种质资源鉴定需要结合多种方法，相互验证，最终确定出薰衣草之间的遗传关系。评价种质资源遗传多样性水平主要参考三个重要参数：有效等位基因数(Ne)、基因多样度(H)和Shannon信息指数(I)，研究得到的薰衣草种植遗传多样性参数Ne=1.399 5，H=0.240 4，I=0.364 3与文献[9]做出的遗传多样性参数Ne=1.454 0，H=0.280 5，I=0.435 4相差不多，均表明薰衣草的遗传多样性水平较低，品种间的亲缘关系较近，是伊犁地区新品种资源创新工作遇到的主要困难。因此，需要不断引进新品种，并利用先进的分子育种手段培育出高产优质新品种，来满足薰衣草产业发展需求。

4　结 论

45种材料共获得83个扩增位点，其中多态性位点60个，平均每个引物扩增位点9.2个；有效等位基因数(Ne)为1.399 5, Nei’s基因多样性指数(H)和Shannon信息指数(I)分别是0.240 4和0.364 3；遗传相似系数介于0.663～0.988；利用UPGMA聚类分析，以遗传相似性系数0.72为界，可将45个薰衣草材料划分为2类。伊犁地区种植的薰衣草品种遗传多样性水平低，品种之间相似性高。

References)

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Fund project:Supported by Youth Foundation of Xinjiang Production and Construction Corps (2014CD007) and Science and Technology Xinjiang Supporting Program of Xinjiang Production and Construction Corps (2014AB010).

Genetic Diversity of Distinctive-spicy Lavender Cultivars in Xinjiang Yili Revealed by ISSR Analysis

GUO Dan-li1, LI Min1, WANG Zi-jian1, JIANG Xin-ming1, HUANG Xian-zhong2,LU Zhe1, WANG Pu1

(1.InstituteofAgriculturalSciences,theFourthAgriculturalProductionDivisionofXinjiangProductionandConstructionCorps，YiningXinjiang835000,China; 2.PlantGenomicsLaboratory,CollegeofLifeSciences,ShiheziUniversity,ShiheziXinjiang832003,China)

【Objective】 This research focuses on assessment of the genetic variability and diversity of lavender (Lavandulapedunculata). 【Method】 Genetic relations among 45 cultivars of lavenders were analyzed by inter-simple sequence repeat (ISSR) makers. 【Result】 A total of 83 ISSR bands were obtained, among which 60 were polymorphic bands. On average, amplification band of the each primer was 9.2 and polymorphism ratio was 72.29%. The dissimilarity coefficient of the 45 lavender cultivars ranged from 0.663 to 0.988. The efficient number of alleles, Nei's genetic diversity, and Shannon's information index of the cultivars varieties were 1.399，5, 0.240，4 and 0.364，3, respectively. The 45 lavender cultivars were divided into 2 groups at the genetic distance 0.72 by UPGMA. The first group contained 44 cultivars and the second group only contained 1 cultivars. 【Conclusion】 The population genetic diversity of 45 lavender cultivars was high and the genetic relationship was close.

lavender (Lavandulapedunculata) in Yili; ISSR remark; genetic diversity; clustering analysis

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.04.017

2015-12-02

兵团青年基金项目(2014CD007)；兵团科技支疆项目(2014AB010)

郭丹丽(1989-)，女，新疆伊犁人，助理研究员，研究方向为特色作物遗传育种，(E-mail)guodanli0@163.com

路喆(1982-)，男，甘肃庆阳人，副研究员，研究方向为香料作物新品种选育及栽培，(E-mail)1178714191@qq.com；王朴(1967-)，女，新疆伊犁人，研究员，研究方向为特色作物，(Email)429513483@qq.com

S573+9

A

1001-4330(2016)04-0716-05