紫色辣椒叶片花青素的纯化及其生物活性分析

胡能兵，隋益虎，林　毅

(1.安徽科技学院 农学院，安徽 凤阳 233100；2.安徽农业大学 生命科学学院，安徽 合肥 230031)



紫色辣椒叶片花青素的纯化及其生物活性分析

胡能兵1，隋益虎1，林毅2

(1.安徽科技学院 农学院，安徽 凤阳 233100；2.安徽农业大学 生命科学学院，安徽 合肥 230031)

大孔树脂；紫色辣椒；抗氧化；生物活性

花色苷具有清除自由基的功效，主要通过提供氢原子与自由基作用，终止链式反应的传递，进而干扰新自由基的增殖，但原料来源和加工工艺的不同会导致其清除自由基的能力有所差异。发酵法提取的紫甘薯色素PSPPs2比常规法提取的PSPPs1和BHT高，尤其是在低浓度(0.2 mg·mL-1)时，其清除DPPH自由基的能力达到92.77%[1]。此外，花色苷还具有抑菌能力。杨梅花色苷提取物对灰霉葡萄孢的抑制能力随浓度增加而提高，浓度为10%时，抑菌率达到29.28%[2]。野生毛葡萄花青素提取物对细菌有较强的抑制作用，随着浓度升高和作用时间的增加，抑菌率升高；但对真菌抑菌效果不明显，尤其是对烟曲霉无作用[3]。

紫色辣椒(Capsicum annuum L)是稀有的辣椒种质资源[4]。本试验拟以提取、浓缩后的紫色辣椒7036的叶片花青素为材料，研究其纯化工艺及影响因素，并对其精制品进行抗氧化和抑菌功能研究，探明其抗氧化和抑菌特性，为其在食品、药品以及化妆品行业的应用提供依据。

1　材料与方法

1.1试验材料

紫色辣椒7036系安徽科技学院辣椒课题组提供。在辣椒营养生长期，取其浓紫色叶片，经液氮研磨，提取叶片花青素，浓缩，用于后续的大孔树脂纯化及冻干，之后获得叶片花青素精制品。

1.2试验方法

1.2.1大孔树脂吸附叶片花青素的正交设计

前期预备试验表明，HPD-100是最适宜紫色辣椒叶片花青素吸附的大孔树脂。设置pH(柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液)、温度、固液比(固体为树脂质量，液体为10 mL浓缩液与40 mL pH缓冲液的混合液)、转速为考查因子，因素水平设计参照文献[5-7]并略作调整，按L16(45)正交表设计进行试验，以吸附前后溶液的吸光度(542 nm)差值为指标(表1)。每处理重复3次，运用DPS软件对上述结果进行极差、方差分析。

表1正交实验设计

Table 1Orthogonal test design

水平A∶pHB:温度/℃C:固液比D:转速(r·min-1)13201∶5010024302∶5015035403∶5020046504∶50250

1.2.2叶片花青素解吸附

准确称取已经吸附紫色辣椒叶片花青素的树脂各2 g，分别加入0，20%，40%，60%，80%，100%的乙醇溶液50 mL，置于摇床中震荡1 h，测定各溶液的吸光度。

1.2.3叶片花青素精制品制备

将解吸附后的液体经过减压、真空浓缩及浓缩液冻干后，获得粉末状精制品，精制品保存于-20℃条件下，用于后续试验。

1.2.4抗氧化性能测定

1.2.5抑菌性能测定

精制品溶液的制备：将粉末状的紫色辣椒叶片色素精制品用25%的乙醇分别稀释至10，5，2.5，1.25 mg·mL-1，分别经过0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌后，保存待用。

培养基平板制备：大肠杆菌、地衣芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、苏云金芽孢杆菌等细菌用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板，根霉和黑曲霉用马铃薯琼脂培养基平板。用无菌水将上述各菌的孢子配制成106～107的悬液，无菌吸取0.2 mL的各菌液涂布至上述平板上。

抑菌试验：采用滤纸片和牛津杯法。滤纸片法：取直径为1 mm的滤纸片，灭菌后浸于过滤除菌含不同浓度的紫色辣椒叶片花青素精制品的液体中1 min，分别铺在接种有大肠杆菌、地衣芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、苏云金芽孢杆菌等细菌和真菌的培养基上。牛津杯法：将灭菌后的外径8 mm、内径6 mm的牛津杯置于平板表面，吸取上述浓度的紫色辣椒叶片花青素精制品溶液0.2 mL至牛津杯中，尽量不要将菌液溢出牛津杯外。用十字交叉法测量抑菌圈直径，取平均值。

2　结果与分析

2.1各因素对大孔树脂吸附紫色辣椒叶片花青素的影响

由表2的极差分析结果可知，影响大孔树脂HPD-100吸附紫色辣椒叶片花青素的各因素依次为：A(pH)>C(固液比)>B(温度)>D(转速)。从各因素来看，理论上达到最大的组合应为A4B3C2D2。方差分析结果显示，在不同pH、温度、固液比和转速条件下，以HPD-100为树脂开展纯化，pH、温度和固液比的不同水平间差异达到极显著水平，而转速各水平间无显著差异。从表2可以看出，在所试验的各排列组合中，最优组合为A4B3C2D4。考虑到理论最优组合与试验最优组合仅有转速上的差异，而转速对试验结果无显著影响，因此，用HPD-100树脂吸附紫色辣椒叶片花青素的最优组合为A4B3C2D4。

表2HPD-100大孔树脂吸附紫色辣椒叶片花青素的正交实验结果

Table 2Result of orthogonal design of purification of anthocyanin from purple pepper leaf by HPD-100

编号ABCD吸光度差值111110.957212221.070313331.067414441.085521231.143622141.042723411.192824321.198931341.2081032431.2091133121.2071234211.3101341421.2591442311.2401543241.3311644131.173K14.1794.5674.3794.699 K24.5754.5614.8544.734K34.9344.7974.7134.592K45.0034.7664.7454.666k11.0451.1421.0951.175 k21.1441.1401.2141.184k31.2341.1991.1781.148k41.2511.1921.1861.167极差R0.2060.0590.1190.036

2.2紫色辣椒叶片花青素的解吸附

乙醇溶液浓度的差异，会导致其极性有所不同，进而影响叶片花青素与大孔树脂的分子间作用力；此外，不同乙醇浓度也会影响叶片花青素在乙醇中的溶解度。本试验选择了0，20%，40%，60%，80%和100%等6种不同浓度的乙醇，分别对湿重为2 g、充分吸附紫色辣椒叶片花青素的树脂进行解吸附(图1)。当乙醇浓度为100%时，树脂解吸附后溶液的最大吸光度为1.248；当乙醇浓度在0～80%之间时，随着乙醇浓度的上升，吸光度呈现先升后降的趋势，在40%乙醇条件下，解吸附树脂HPD-100后溶液的吸光度最大，为0.774。由于乙醇浓度过高会不利于冻干和粉状精制品的获得，故选择40%的乙醇作为解吸附最适乙醇浓度。

2.3紫色辣椒叶片花青素抗氧化性能

2.4紫色辣椒叶片花青素抑菌性能

采用滤纸法分别比较了紫色辣椒叶片花青素精制品对4种细菌和2种真菌的抑菌效果，结果见表3。当紫色辣椒叶片花青素精制品浓度为5 mg·mL-1时，对真菌(根霉、黑曲霉)和细菌都没有抑菌效果。在高浓度条件下，即当精制品浓度为10 mg·mL-1时，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和地衣芽孢杆菌有一定的抑菌效果，通过抑菌圈直径可知，其对上述细菌的抑菌效果依次为：大肠杆菌>金黄色葡萄球菌>地衣芽孢杆菌。

运用牛津杯法比较了紫色辣椒叶片花青素精制品对4种细菌和2种真菌的抑菌效果，结果见表3。当紫色辣椒叶片花青素精制品浓度为5 mg·mL-1时，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和地衣芽孢杆菌就表现出了抑菌作用，但对真菌(根霉、黑曲霉)没有抑菌效果。由抑菌圈直径可知，其对上述细菌的抑菌效果依次为：大肠杆菌>金黄色葡萄球菌=地衣芽孢杆菌。当紫色辣椒叶片花青素精制品浓度提高到10 mg·mL-1时，其抑菌效果与5 mg·mL-1时略有不同，对4种细菌均表现出明显的抑菌作用。由抑菌圈直径可知，高浓度花青素精制品对4种细菌的抑菌效果依次为：金黄色葡萄球菌>大肠杆菌>地衣芽孢杆菌>苏云金芽孢杆菌。

图1　乙醇浓度对HPD-100树脂解吸附的影响Fig.1　Influence of ethanol concentration on desorption of HPD-100

图2　紫色辣椒叶片色素精制品对羟自由基(·OH)、超氧阴离子·)及DPPH的清除效果Fig.2　Elimination effect of purple pepper leaf anthocyanin on ·OH(A)，superoxide anion(B) and DPPH(C)

表3紫色辣椒叶片花青素精制品对菌种的抑制作用(mm)

Table 3Antimicrobial effect of different concentrations of purple pepper leaf anthocyanin (mm)

试验方法浓度/(mg·mL-1)大肠杆菌金黄色葡萄球菌地衣芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌根霉黑曲霉滤纸法5——————108.377.637.20———牛津杯法511.010.510.5———1016.517.514.512.5——

3　讨论

关于花色苷、花青素的抗氧化性能，目前已有较多报道，其在减缓或治疗心血管疾病、血液循环障碍等方面具有实际意义。然而，国内关于花青素等物质在抑菌方面的报道较少，仅限于紫甘薯、山楂、葡萄籽等少量植物[9-17]。甘薯是花青素的主要来源，王关林等[15]以甘薯块根花青素(SPAC)为原料，发现其对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和大肠杆菌都有不同程度的抑制作用，尤以金黄色葡萄球菌对SPAC的敏感性最强。其机理可能为：花青素的分子结构含有较多的酚羟基，可与蛋白质或酶通过氢键结合，引起菌体严重的质壁分离、细胞质固缩，并解体成空泡，从而导致细胞死亡。

此前，尚未有紫色辣椒叶片花青素精制品制备及其生物活性的研究报道。本试验研究表明，紫色辣椒叶片可作为花青素的新来源，影响大孔树脂HPD-100吸附紫色辣椒叶片花青素的因素大小顺序为：A(pH)>C(固液比)>B(温度)>D(转速)，40%乙醇可作为解吸附的最适乙醇浓度。对花青素精制品的分析表明，其具有一定的抗氧化能力，尤其是对羟自由基(·OH)的清除效果要优于Vc。考虑到本试验中所采用的花青素精制品在制备过程中涉及诸多的高温环节，对花青素有一定的破坏作用，可能导致花青素含量的损失，影响花青素的抗氧化性能，因此，运用新技术减少高温环节或缩短高温处理时间，有望极大提升紫色辣椒叶片花青素的商品价值。

食品工业中，以细菌、霉菌和酵母菌等为代表的微生物常常会导致食品败坏，而化学防腐剂大都具有一定的毒性，长期或过量使用会极大损害人体的健康。将天然产物，如花色苷等用于食品保存，或将天然产物与现有防腐剂复配，既可减少防腐剂的用量，又会赋予食品特有的营养保健功能，具有很高的开发潜能。本研究的抗菌试验表明，紫色辣椒叶片花青素对细菌，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、地衣芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌等都有一定的抑制效果，对真菌无抑制作用。而申杰[2]研究认为，杨梅花色苷对灰霉葡萄孢有抑制效果。这种差异可能与花青素的来源和类型有关。

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(责任编辑高峻)

Purification of anthocyanin from purple pepper leaf and its bio-activities

HU Neng-bing1，SUI Yi-hu1，LIN Yi2

(1.College of Agriculture，Anhui Science and Technology University，Fengyang 233100，China;2.College of Life Science，Anhui Agricultural University，Hefei 230031，China)

macroporous resin;purple pepper;anti-oxidation;bio-activities

浙江农业学报Acta Agriculturae Zhejiangensis，2016，28(3):452-456http://www.zjnyxb.cn

胡能兵，隋益虎，林毅.紫色辣椒叶片花青素的纯化及其生物活性分析 [J].浙江农业学报，2016，28(3)： 452-456.

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.03.15

2015-06-25

安徽省教育厅重点项目(KJ2014A057)；国家星火计划(2012GA710028)；安徽科技学院自然科学项目(ZRC2013374)

胡能兵(1980—)，男，安徽东至人，博士，副教授，从事园艺植物组织培养及育种工作。E-mail∶hunengbing@126.com

S63

A

1004-1524(2016)03-0452-05