内蒙古巴彦淖尔地区临床型奶牛乳腺炎病原菌的鉴定

赵玉娥，赵智香，赵丽霞，樊国泰

（1.河套学院，内蒙古 临河区 015000；2.金宇保灵生物药品有限公司，内蒙古 呼和浩特 010030；3.内蒙古乌拉特前旗动物疫病预防控制中心，内蒙古 乌拉特前旗 014400）

内蒙古巴彦淖尔地区临床型奶牛乳腺炎病原菌的鉴定

赵玉娥1，赵智香1，赵丽霞2，樊国泰3

（1.河套学院，内蒙古 临河区 015000；2.金宇保灵生物药品有限公司，内蒙古 呼和浩特 010030；3.内蒙古乌拉特前旗动物疫病预防控制中心，内蒙古 乌拉特前旗 014400）

不同地区奶牛乳腺炎的主要致病菌不同，其发病率也存在很大的差异。为了进一步明确内蒙古巴彦淖尔地区奶牛乳腺炎的发病情况，以巴彦淖尔地区4家奶牛场临床型乳腺炎患牛为实验对象，采集80份乳样进行了病原菌的分离培养及生化鉴定，结果分离到51个菌株，其中有葡萄球菌31株，链球菌6株，肠杆菌14株。该试验明确了该地区奶牛乳腺炎的主要致病菌，为该地区奶牛乳腺炎的有效防治及临床上合理地筛选敏感药物提供了有利的依据。

临床型；奶牛；乳腺炎；病原菌；鉴定

奶牛乳腺炎是由病原微生物感染而引起乳房组织与乳头发炎的一种疾病，是奶牛常见病之一。该病对世界乳制品行业危害性很大。随着奶牛业和乳品工业的不断发展，以及人类对公共卫生愈来愈重视，奶牛乳腺炎的危害已引起了人们的极大关注。研究发现，世界上多数国家奶牛乳腺炎的发病率约为40%，每头患牛产奶量平均减少15%［1-2］。我国奶牛乳腺炎发病率高于世界平均水平，据报道临床型乳腺炎发病率为9.7%～55.6%［3］。不同地区奶牛乳腺炎的主要致病菌不同，奶牛乳腺炎的发病率也存在很大的差异。同一致病菌在不同时间的耐药性也不同，在诊疗上如果照搬其他地区的防治措施，很难起到明显的效果。因此，根据不同地区乳腺炎的发病情况，确定其主要致病菌，可以为该地区乳腺炎的防治提供有利的依据。

内蒙古巴彦淖尔地区近年来奶牛养殖发展迅速，目前拥有奶牛总数达1万多头。随着养殖规模的扩大，由于饲养管理水平、疾病防治技术有限，致使该地区奶牛乳腺炎不断发生。巴彦淖尔地区奶牛乳腺炎的主要病原菌也有其地区特点，到目前为止当地对该病的研究工作很少，对主要病原菌及其耐药性比较模糊。因此，对巴彦淖尔地区奶牛场的乳腺炎病原菌进行研究有实际意义。通过对巴彦淖尔地区不同奶牛场临床型奶牛乳腺炎的发病情况和主要病原菌进行研究，为该地区奶牛乳腺炎的有效防治提供实验依据，以指导临床上合理地筛选敏感药物，帮助各牛场进行乳腺炎的预防和治疗，对巴彦淖尔地区乳业的发展和经济发展起到积极作用。

1 试验材料

1.1 奶样采集用具灭菌离心管（10 mL）、镊子、75%酒精棉球、碘酊、冰盒、记号笔等。

1.2 病原菌分离培养基绵羊鲜血琼脂培养基、麦康凯琼脂、营养琼脂、水解酪蛋白琼脂（MH）、生化培养基等均购自杭州微生物试剂有限公司。

1.3 试剂革兰氏染色剂、兰州隐性乳房炎诊断液（LMT），以及各种生化微量鉴定管等，购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.4 实验仪器接种针、显微镜（具有浸油镜头的生物显微镜）、恒温箱、干燥器、高压锅。

1.5 乳样巴彦淖尔地区4个奶牛场的临床型奶牛乳腺炎患牛乳样共80份。

2 实验方法

2.1 临床检查临床型乳腺炎症状明显，根据乳汁和乳房的眼观变化即可判断：奶牛乳房出现不同程度的发热和疼痛，有不同程度肿胀或触诊可摸见肿块；乳汁有絮片、凝块，变色等。

2.2 乳样的采集与体细胞计数

2.2.1 采集乳样：对已经表现出临床症状的奶牛乳腺炎病例进行乳样采集。采样前先用温水洗涤乳房，之后用0.2%新洁尔灭消毒，最后用75%的酒精擦拭乳头。待乳头表面皮肤干燥后，每个乳头先挤去头2～3把奶，以排除一些污染的杂菌，然后以无菌操作的方法取奶样5 mL（各个乳室分开），标明牛号、乳室、日期后送检。若远途运输则需将乳样放于冰盒中，当天送检。

图1 乳汁呈现不同的眼观变化

2.2.2 体细胞计数：在事先画好的有1 cm×1 cm方格的白纸上放1张洁净的载玻片，摇匀乳样，取乳样10 μL滴于方格内，每一乳样涂2格，涂匀，放置于温箱中使之干燥后用小滴管吸取少量酒精滴于标本涂面上，再放在干燥箱中将标本固定5 min，然后用革兰氏染色液迅速染色，甩去余液，待干燥后，用蒸馏水轻轻地漂洗，待干燥后将标本置于显微镜的油镜下，选择50个有代表性的视野，用计数器分别记录标本中体细胞的种类及数量，最后求出每个视野体细胞数的平均值（计算时无细胞核的块状物质及细胞碎片不计数，多核型白细胞数作1个细胞，在视野边缘处，凡能看到整个细胞一半以上的部分时，都要计数）。

通过镜检，算得每个视野中平均含有的体细胞数，再乘以每毫升奶样可涂抹出的视野数（即显微镜系数），即可计算出每毫升奶样中含有的体细胞数。

2.3 病原菌的鉴定

2.3.1 形态学鉴定：按各种病原菌在不同培养基中的生长印象、生长情况，将所分离到的菌进行初步分类，分成葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌，从而为生化鉴定初步选定鉴定项目。

2.3.2 生化鉴定：根据形态学鉴定结果，对所分离到的病原菌分别用细菌生化编码鉴定管进行分类鉴定。

图2 分离菌的菌落形态

图3 分离菌菌体的形态特征

3 结果

3.1 奶牛乳腺炎病例的临床症状及乳汁性状大多数患牛乳房肿胀，触之有压痛感，且患病乳区乳房明显变硬。乳汁呈现不同的眼观变化（见图1a），如血样乳（见图1b）、水样乳（见图1c）、乳中出现团块状沉淀和漂浮物（见图1d）等。

3.2 临床型奶牛乳腺炎病例牛乳体细胞计数结果临床型乳腺炎病例牛乳性状基本上都有明显的眼观变化，但有的乳样性状无眼观变化但体细胞数却很高。对80份乳样中能够分离出病原菌的牛乳进行体细胞计数，牛乳体细胞数 （SCC）均值为140.27×104个/mL。

3.3 细菌分离鉴定结果

3.3.1 细菌菌落、菌体的形态特征

3.3.1.1 葡萄球菌的菌落、菌体的形态特征：菌落呈乳白色或灰白色，不透明，在血琼脂上长势旺盛（见图2a）。涂片，革兰氏染色后，镜检，葡萄球菌为革兰氏阳性，呈圆形，较大，有的单个，有的成簇（见图 3a）。

3.3.1.2 链球菌的菌落、菌体的形态特征：血琼脂上菌落呈灰白色，透明或半透明，隆起，生长旺盛（见图2b）。涂片，革兰氏染色后，镜检，链球菌为革兰氏阳性，圆或椭圆，菌体较小，呈链状排列（见图3b）。

3.3.1.3 大肠杆菌的菌落、菌体形态：菌落生长旺盛，不透明，发黄，表面光滑，湿润（见图2c）。涂片，革兰氏染色后，镜检，大肠杆菌为革兰氏阴性，呈短杆状（见图 3c）。

3.3.2 临床型乳腺炎病原菌分离鉴定结果：采集巴彦淖尔地区4家奶牛场 （分别记为S6、S2、Q、H）临床型乳腺炎病例的80份乳样，进行细菌分离鉴定，结果共检出51株病原菌，有葡萄球菌属31株、肠杆菌属细菌14株、链球菌属细菌6株，其中葡萄球菌占60.78%、肠杆菌占27.45%、链球菌占11.77%。

各牧场病原菌分离鉴定情况见表1～表4。

3.3.3 巴彦淖尔地区4家牧场临床型奶牛乳腺炎病例病原菌分离率比较：由图4可知，不同牧场分离出的临床型乳腺炎主要病原菌有一个共同特点，即金黄色葡萄球菌的分离率最高，分离出的革兰氏阴性杆菌以埃希氏大肠杆菌为主，而链球菌属的分离率比较低。

表1 S6牧场临床型奶牛乳腺炎病原菌分离鉴定结果

表2 S2牧场临床型奶牛乳腺炎病原菌分离鉴定结果

表4 H牧场临床型奶牛乳腺炎病原菌分离鉴定结果

4 讨论

4.1 同一地区不同奶牛养殖场分离菌种比较该试验对巴彦淖尔地区4个规模奶牛养殖场的临床型奶牛乳腺炎病例进行常规的细菌分离鉴定，并对其细菌分离率进行了比较。结果发现，同一地区不同养殖场，病原菌的种类和病原菌分离率不同，这也反映了奶牛乳腺炎因其致病菌不同、养殖条件及养殖环境不同，发病率也有所不同。S6牧场临床型奶牛乳腺炎病例分离的菌株主要以葡萄球菌和埃希氏大肠杆菌为主，S2牧场临床型奶牛乳腺炎病例分离到的菌株主要以葡萄球菌为主，没有分离到链球菌属。Q牧场、H牧场的主要致病菌同样是葡萄球菌。观察发现，S2牧场的环境卫生及设备是4家牧场中条件最好的，可见饲养管理与奶牛乳腺炎的发病率有一定的关系。

4.2 细菌分离鉴定结果与其他地区的比较总结巴彦淖尔地区奶牛乳腺炎病原分离率可知：临床型奶牛乳腺炎葡萄球菌的分离率为60.78%，肠杆菌为27.45%，链球菌为11.77%。与呼和浩特地区奶牛乳腺炎研究比较，刘蕾2006年报道呼和浩特地区临床型奶牛乳腺炎葡萄球菌分离率为45%，链球菌为32%，肠杆菌为10.67%［4］，刘珍认为呼和浩特地区临床型奶牛乳腺炎病原菌中金黄色葡萄球菌占22.4%，链球菌为 14.28%，肠杆菌占 46.83%［5］。该试验结果与国内其他地区研究结果比较，李宏胜（2011）表明奶牛乳房炎病原菌主要以无乳链球菌为主［6］。其他一些研究报道乳房炎病原菌主要以金黄色葡萄球菌为主［7-8］。

表3 Q牧场临床型奶牛乳腺炎病原菌分离鉴定结果

图4 临河地区四家牧场临床型奶牛乳腺炎病例病原菌分离率比较

随着我国奶牛集约化养殖方式的普及、乳房炎综合防治措施及各种治疗药物的广泛应用，乳房炎主要病原菌区系分布也在不断变化，这与采集地域、牛场环境、采集时间以及饲养管理水平等因素都有一定的关系。

5 结论

综上所述，不同地区临床型奶牛乳腺炎的主要致病菌有所不同，巴彦淖尔地区临床型奶牛乳腺炎的主要致病菌是葡萄球菌 （以金黄色葡萄球菌为主），其次是大肠杆菌。

［1］高玉君，周建胜，马慧玲，等.泰安市奶牛乳腺炎调查及病原菌分离鉴定［J］.食品与药品，2005，7（9）：53.

［2］KEHRLI ME Jr，SHUSTER D E.Factors affecting milk somatic cells and their role in health of the bovine mammary gland［J］.J Dairy Sci，1994，77（2）：619-627.

［3］李宏胜，郁杰，李新圃，等.奶牛乳房炎病原菌区系分布及发病规律研究进展［J］.动物医学进展，2005，26（6）：146-149.

［4］刘蕾.呼和浩特地区临床型奶牛乳腺炎致病菌筛选及其对小白鼠致病性的研究［D］.呼和浩特：内蒙古农业大学，2006.

［5］刘珍.呼和浩特地区临床型奶牛乳腺炎病原分离鉴定及其对小白鼠致病性的研究［D］.呼和浩特：内蒙古农业大学，2005.

［6］李宏胜，罗金印，李新圃，等.我国奶牛乳房炎病原菌区系调查及抗生素耐药性检测 ［C］//中国畜牧兽医学会家畜内科学分会第七届代表大会暨学术研讨会论文集（下册）.南昌：中国畜牧兽医学会家畜内科学分会，2011.

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Isolation and Identification of Pathogenic Bacteria Associated with Clinical Bovine Mastitis in Bayannur Area of Inner Mongolia

ZHAO Yu-e1，ZHAO Zhi-xiang1，ZHAO Li-xia2，FAN Guo-tai3
（1.Hetao College，Linhe District 015000，China；2.The Spirit Jinyu Biological Pharmaceutical Co.，Ltd.， Hohhot 010030，China；3.Animal Disease Prevention and Control Center of Urad Front Banner of Inner Mongolia,Urad Front Banner 014400，China）

The species of pathogenic bacteria causing dairy cow mastitis varied in different geographic areas,and the incidences of mastitis in different dairy farms also varied.In order to understand the epidemiology characteristics of bovine mastitis in Bayannur area of Inner Mongolia,a total of 80 milk samples were collected from dairy cows with clinical mastitis in four different dairy farms.A total of 51 bacterial strains were isolated and phenotypically identified,including 31 Staphylococcus isolates，6 Streptococcus isolates,and 14 isolates of enteric bacilli.The results of this study was helpful for the understanding of species distribution of main pathogenic bacteria associated with dairy cow mastitis in this region,and may provide scientific basis for the effective prevention and control of bovine mastitis and rational use of antimicrobial agents in veterinary clinic.

clinical mastitis；dairy cow；pathogenic bacteria；identification

S858.23；S852.61

A文章顺序编号：1672-5190（2016）01-0006-04

2015-12-14

赵玉娥（1974—），女，副教授，硕士，主要研究方向为动物疫病防治。

赵智香（1978—），女，讲师，硕士，主要研究方向为动物疫病防治。

（责任编辑：钱英红）