UPLC-MS/MS法同时测定安喘舒丸中腺苷和黄芪甲苷含量

华云鹏，雍太萍，宗宁峰，许桂丽，陆瑜

(解放军第454医院 药学部，江苏 南京 210002)

UPLC-MS/MS法同时测定安喘舒丸中腺苷和黄芪甲苷含量

华云鹏，雍太萍，宗宁峰，许桂丽，陆瑜*

(解放军第454医院 药学部，江苏 南京 210002)

目的建立同时测定安喘舒丸中腺苷、黄芪甲苷含量的方法。方法采用液质联用技术，以甲醇-0.1%甲酸溶液为流动相等度洗脱，以Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱为分析柱，通过电喷雾离子源，选择正离子模式多反应监测方式检测。结果腺苷、黄芪甲苷的线性范围分别为10～320 ng·mL-1(r=0.996 8)、5～160 ng·mL-1(r=0.995 5)，加样回收率在96.17%～99.48%，RSD均低于1.14%。结论该法专属性强、快速灵敏，可用于安喘舒丸中腺苷、黄芪甲苷的含量测定。

安喘舒丸；腺苷；黄芪甲苷；超高效液相色谱-串联质谱法

安喘舒丸是解放军第454医院自行研制的临床常用中药制剂，由紫河车、黄芪等药材组成，主要用于治疗慢性支气管炎并预防复发，疗效显著。黄芪具有补气升阳、行滞通痹的功能，临床用于治疗中气下陷、气虚乏力[1-2]；紫河车具有温肾补精、益气养血的功能，临床用于治疗食少气短，久咳虚喘[1]。

慢性支气管炎是呼吸科较为常见的一种疾病，病因是患者非感染或感染因素而引发的支气管黏膜、气管及其周围组织的非特异性的慢性炎症[3-5]。有研究表明，紫河车中的腺苷和黄芪中的黄芪甲苷均有明显的抗炎作用[6-9]。

为了控制安喘舒丸的质量，研究建立一种安喘舒丸相关物质快速、简便、准确的测定方法显得尤为重要。本研究的主要目的是建立一种基于超声波提取和超高效液相色谱-串联质谱同时测定安喘舒丸中腺苷和黄芪甲苷的快速简便方法，旨在为安喘舒丸的质量评价提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1290超高效液相色谱仪、Agilent 6430 LC-MS三重四级杆质谱仪[配有电喷雾化离子源(ESI)]、色谱工作站(MassHunter)；AE240电子天平(上海梅特勒-托利多有限公司)；MICRO-17R冷冻离心机(美国Thermo公司)；WH-2微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂)；Drict-Q5超纯水机(法国Millipore公司)。

1.2 试药

安喘舒丸(中国人民解放军第454医院，批号分别为150601，150320，150805，150710，150920，150410)；对照品腺苷、黄芪甲苷(中国食品药品检定研究院，批号分别为110879-200202，110781-200613)；水为超纯水；甲酸、甲醇、乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱及质谱检测条件

Agilent ZOBAX SB C18色谱柱(150 mm×2.1 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.1%甲酸水溶液(25∶75)；流速：200 μL·min-1；柱温：35 ℃；进样量：2 μL。离子源：ESI；离子化模式：正离子；定量模式：多反应监测模式(MRM)；毛细管电压：4000 V；干燥气温度：400 ℃；腺苷的Fragmentor及CE值分别为100、20 V；黄芪甲苷的Fragmentor及CE值分别为120、70 V；检测对象：腺苷m/z268.1→m/z136；黄芪甲苷m/z808.2→m/z628.5。

2.2 对照品溶液的制备

分别取腺苷、黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加入50%甲醇水溶液溶解定容，配置成腺苷(320 ng·mL-1)、黄芪甲苷(160 ng·mL-1)的混合对照品溶液。依次进行倍比稀释，结果见表1。

表1 化学对照品LC-MS分析浓度信息 /ng·mL-1

2.3 供试品溶液的制备

将安喘舒丸于40 ℃烘箱中干燥至恒重，粉碎后过200目筛，精密称取0.5 g干燥粉末，置于100 mL容量瓶中，加入90%甲醇水溶液定容，超声处理30 min，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1 mL，置10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。按2.1项下条件下进行测定，见图1。

注：A.对照品；B.安喘舒丸；1.腺苷；2.黄芪甲苷。图1 液-质联用离子流图

2.4 线性关系

分别精密吸取2.2项下系列混合对照品溶液2 μL，按照2.1色谱条件进样测定，以峰面积(Y)为纵坐标，浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线。腺苷回归方程：Y=104 527X+12 258(r=0.996 8),定量下限为10 ng·mL-1;黄芪甲苷回归方程：Y=46 826X+1366(r=0.999 5),定量下限为5 ng·mL-1。

2.5 精密度试验

取低、中、高3个浓度(选取HB5、HB4、HB2)的混合对照品分别重复进样5次，进样量2 μL，按2.1项下进行测定，记录峰面积。结果腺苷的RSD分别为3.2%、3.4%、3.6%；黄芪甲苷的RSD分别为3.5%、2.1%、2.6%，表明该方法准确性较好。

2.6 稳定性试验

取同一批号(150601)样品，分别于0、4、8、12、24 h按2.1项下方法进行测定。结果腺苷、黄芪甲苷峰面积的RSD分别为3.1%、2.4%，结果表明样品溶液在24 h内稳定。

2.7 重复性试验

分别取同一批号样品(150601)5份，按供试品溶液的制备方法操作依法测定。结果腺苷、黄芪甲苷峰面积的RSD分别为2.9%、3.4%，表明该方法重复性较好。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的同一批样品(批号：150601)约0.25 g，分别精密加入各对照品溶液适量，按2.3项下方法制备，依法测定，按下式计算回收率。结果见表2。

表2 加样回收率试验结果(n=6)

2.9 样品测定

取6批安喘舒丸，按2.3项下方法制备供试品溶液，分别进样2 μL，并按2.1项下条件测定，计算各批安喘舒丸中腺苷、黄芪甲苷的含量，结果见表3。

表3 安喘舒丸中2种化学成分含量测定结果 (n=6) /μg·g-1

3 讨论

试验前期曾采用高效液相色谱法检测安喘舒丸中的成分，但存在各成分相互干扰严重，无法进行准确的定量分析，某些成分含量低，无明显的响应信号，操作繁琐、灵敏度低、分析速度慢、多成分含量同时测定色谱条件摸索困难等问题。

通过对不同规格的色谱柱进行比较，结果采用Agilent ZOBAX SB C18色谱柱(150 mm×2.1 mm，5 μm)，所得色谱峰保留时间适中，峰形较好。试验中分别尝试采用正、负2种离子模式，发现正离子模式下的离子化效率明显高于负离子模式。同时，考察了流动相的组成与比例对分析结果的影响，结果表明，当甲醇与0.1%甲酸水溶液的比例为25∶75时，2个化合物分离良好，彼此不会相互影响，且均在2 min内出峰。

本试验采用UPLC-MS/MS法同时测定安喘舒丸中腺苷、黄芪甲苷的含量，该方法具有干扰少、分析时间短、灵敏度高、专属性强的特点，为科学控制安喘舒丸提供了可靠而简单的方法，并拟定内控标准：腺苷含量不低于200 μg·g-1，黄芪甲苷含量不低于120 μg·g-1。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015.

[2] 王敏杰，金蓉，李慧芳，等.蒙古黄芪总黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用[J].中南药学，2015，13(2)：147-150.

[3] 彭淑芳.中医辨证治疗80例慢性支气管炎的临床研究[J].亚太传统医药，2012，8(3)：73-74.

[4] 陈晓红.老年慢性支气管炎42例治疗体会[J].现代诊断与治疗，2012，23(4)：333-334.

[5] 陈平.β2受体激动药在慢性阻塞性肺疾病中应用现状[J].中南药学，2003，1(5)：293-295.

[6] 蒋激扬，刘发.腺苷的抗炎作用[J].中国药理学通报，1998，14(S1)：79-82.

[7] 曹淑花，玄玲玲，王冬梅，等.腺苷衍生化合物WS070117M1对小鼠慢性阻塞性肺疾病的影响及其抗炎机制[J].药学学报，2015，50(8)：986-992.

[8] 王琳，闫晨.玉屏风散中黄芪甲苷的制备及抗炎作用的研究[J].天津药学，2007，19(1)：31-32.

[9] 朱燕辉，严奉祥.黄芪甲苷及其生物学活性[J].现代生物医学进展，2008，8(4)：781-783.

SimultaneousDeterminationofAstragalosideⅣandAdenosineinAnchuanshuPillbyUPLC-MS/MS

HUAYunpeng，YONGTaiping，ZONGNingfeng，XUGuili，LUYu*

(The454thHospitalofPLA，Nanjing210002，China)

Objective：To develop a UPLC-MS/MS method for the determination of adenosine and astragaloside Ⅳ in Anchuanshu Pill.MethodsIsocratic elution was carried out with mobile phase consisting of methanol-0.1% formic acid.The separation was performed on an Agilent ZORBAX SB-C18 column，and the mass spectrometer was operated in the positive ionization electrospray (ESI) mode using multiple monitoring (MRM) for analysis of two components.ResultsAdenosine and astragaloside Ⅳ were all determined exactly，the linear ranges were 10-320 ng·mL-1(r=0.996 8)，5-160 ng·mL-1(r=0.995 5)，respectively.The recoveries of two analytes ranged from 96.17%-99.48% and the relative standard deviations were all below 1.14%.ConclusionA sensitive，accuracy and suitable UPLC-MS/MS method has been developed，and the method could be applied for the determination of adenosine and astragaloside Ⅳ in Anchuanshu Pill.

Anchuanshu Pill；adenosine；astragaloside Ⅳ；UPLC-MS/MS

2016-01-07)

*

陆瑜，博士，研究方向：医院药学；Tel：(025)80865133，E-mail：liuzixiu3221@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.8.026