HPLC测定马黛茶中咖啡因和可可碱含量

陈静，胡海峰

(中国医药工业研究总院 国药集团健康产业研究院有限公司，上海 200040)

HPLC测定马黛茶中咖啡因和可可碱含量

陈静，胡海峰*

(中国医药工业研究总院 国药集团健康产业研究院有限公司，上海 200040)

目的建立了同时测定马黛茶生物碱(可可碱和咖啡因)含量的高效液相色谱法。方法采用华谱Unitary C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，以甲醇和0.5%甲酸水溶液为流动相，流速为1.0 mL·min-1，检测波长为280 nm。结果马黛茶中可可碱和咖啡因在5.010～200.0 μg·mL-1呈现良好线性关系，r均大于0.999，RSD均小于1.70%，平均回收率分别为96.59%和97.20%。结论该方法简便、准确、灵敏、重复性好，可用于马黛茶的质量控制。

马黛茶；生物碱；可可碱；咖啡因；HPLC

马黛Ilexparaguaynensis生长于南美丛林，是冬青科大叶冬青近似的一种多年生木本植物，树上嫩叶经人工采摘、烘焙，就制成了南美人常饮用的巴拉圭茶，俗称马黛茶，与咖啡、茶(红茶、绿茶等)并称为“世界三大茶”[1]。马黛茶富含196种活性元素，长期饮用可改善人体内环境，提升血液品质，全面保持机体营养平衡，是迄今为止人类发现的能实现双向生理调节作用的少数几种单科植物之一[2-3]。除了马黛多酚，生物碱也是马黛茶的主要活性成分，含量最多的是咖啡因和可可碱[4]。目前国内对马黛茶生物碱的分析及定量研究均未见报道。本研究建立HPLC定量分析马黛茶中2种生物碱的方法，有助于完善马黛茶的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 1525二元泵，2707自动进样器，2998DAD检测器，Breeze色谱工作站；BUCHI R-200旋转蒸发仪 (瑞士Buchi公司)；粉碎机(XL-400B型)；分析天平(METTLER TOLEDO AG135)；eppendorf Research plus(100 μL、200 μL、1 mL)。

1.2 试药

对照品：可可碱(上海诗丹德生物技术有限公司，批号：1056/15687，含量≥98.0%)；咖啡因(上海诗丹德生物技术有限公司，批号：1392/15686，含量≥98.0%)；青色和黄色马黛茶(巴西BARAO马黛茶)；甲醇为色谱级，其余试剂均为分析纯，水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为华谱Unitary C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为0.5%甲酸水溶液(A)和甲醇(B)；采用梯度洗脱(0～10 min，90%A，10%B；10～30 min，50%A，50%B)；流速为1.0 mL·min-1，检测波长为280 nm；柱温为室温；进样量为10 μL；分离度大于1.5；理论塔板数按可可碱峰和咖啡因峰计算不低于5000。HPLC图见图1。

注：A.混合对照品；B.提取物样品；1.可可碱；2.咖啡因。图1 马黛茶提取物及混合对照品HPLC图

2.2 混合对照品溶液的制备

2.2.1 可可碱对照品的制备 由于可可碱在水中的溶解度较小，需要在热水中溶解。精密称定可可碱对照品10.00 mg，加水溶解并定容到25 mL容量瓶中制成对照品贮备液。使用时根据需要用水稀释至相应的浓度。

2.2.2 咖啡因对照品的制备 精密称定咖啡因对照品10.00 mg，加水溶解并定容到10 mL容量瓶中制成对照品贮备液。使用时根据需要用水稀释至相应的浓度。

2.2.3 可可碱和咖啡因混合对照品溶液制备 分别取可可碱、咖啡因对照品贮备液250、100 μL，将其混合液定容至1 mL，配制成混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备[5]

将青色马黛茶粉碎，过32目筛备用，称取青色马黛茶3.00 g，加入60 mL娃哈哈纯净水，在80 ℃下回流提取1.0 h，趁热过4层纱布，定容至50 mL的容量瓶中，经0.22 μm微孔滤膜过滤后作为供试品溶液。

2.4 线性关系考察

精密称取可可碱对照品适量，加水制成每1 mL含可可碱0.400 mg的溶液，即得。精密称取咖啡因对照品适量，加水制成每1 mL含咖啡因1.000 mg的溶液，即得。将上述可可碱和咖啡因对照品分别依次稀释，制成一系列浓度的对照品溶液，进行测定。以对照品的质量浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，分别绘制标准曲线，计算回归方程，结果可可碱在5.010～200.0 g·mL-1、咖啡因在5.010～200.0 g·mL-1线性关系良好，符合外标法定量测定的要求。可可碱回归方程：Y=36 123X-66 922(r=0.999 1)。咖啡因回归方程：Y=21 852X-13 916(r=0.999 8)。

2.5 精密度试验

精密吸取同一份供试品溶液(批号：20150208)，按2.1色谱条件下重复进样6次，记录可可碱和咖啡因的峰面积，结果可可碱和咖啡因峰面积的RSD分别为0.70%、0.61%，结果表明，所用仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品(批号：20150208)，分别于0、2、4、6、8、19、24 h，按2.1色谱条件进样测定，考察其稳定性，结果可可碱和咖啡因峰面积的RSD分别为0.38%、0.90%，结果表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.7 重复性试验

取同一批样品(20150208)6份，按2.3方法制备供试品溶液，按2.1色谱条件进样测定，记录峰面积，结果可可碱和咖啡因峰面积的RSD分别为1.34%、1.65%。结果表明，该方法重复性良好。

2.8 回收率试验

称取已知含量的样品(批号：20150208，可可碱质量分数为0.020%，咖啡因质量分数为0.13%)样品6份，每份约2.0 g，精密称定，分别加入一定量的可可碱和咖啡因对照品溶液，按照2.3方法制备供试品溶液，按照2.1方法进样测定，计算回收率，结果见表1。

表1 马黛茶中可可碱和咖啡因回收率测定

2.9 样品测定

各种马黛茶叶样品按2.3方法平行制备3份样品溶液，在2.1色谱条件下进样分析，计算结果见表2。

表2 不同马黛茶产品中生物碱含量测定(n=3) /mg·g-1

注：总生物碱的质量分数为可可碱、咖啡因的质量分数之和。

3 讨论

3.1 流动相的选择

本实验最初选择等度洗脱，流动相比例为甲醇-水(15∶85)，在该条件下进样，发现可可碱和咖啡因对照品液相图谱存在拖尾现象。为了解决拖尾现象，可在流动相中添加酸[6-7]，如：磷酸、甲酸、乙酸。由于磷酸的酸性较强，容易损坏仪器和柱子，因此选用甲酸。流动相选为甲醇-0.5%甲酸溶液，实验结果表明，加入甲酸后，可可碱和咖啡因对照品液相图谱中峰的拖尾现象明显减少。

3.2 检测波长的选择

采用二极管阵列检测器对2种生物碱对照品进行波长扫描，可可碱和咖啡因最大波长均在272 nm，其280 nm处生物碱的吸收与270 nm处无明显差异，通过对比有关马黛茶生物碱参考文献中可可碱和咖啡因的含量测定方法，检测波长定为280 nm[8-9]。

3.3 梯度条件的优化

由于马黛茶水提物中存在多种物质，等度洗脱无法将样品中的各种物质很好地分离，因此本实验进行了多种梯度洗脱条件研究，最终确定以下洗脱程序：0～10 min，甲醇为10%；10～30 min，甲醇为50%。在此梯度条件下，可可碱和咖啡因均能得到较好的分离，峰形良好，保留时间稳定。

实验建立的分析方法简便、准确、分离度与稳定性好，可作为马黛茶的质量控制方法。

[1] 赵琪，臧晓韵，胡海峰.马黛茶多酚的加压毛细管电色谱法的定量分析[J].食品与发酵工业，2015，41(1):234-238.

[2] Márquez V，Martínez N，Guerra M，et al.Characterization of aroma-impact compounds in yerba mate (Ilex paraguariensis) using GC-olfactometry and GC-MS[J].Food Research International，2013，53(2)：808-815.

[3] 于少泓，吴俊玲，刘昭纯.马黛茶临床作用研究进展[J].山东中医药大学学报，2010，34(4)：370-372.

[4] 吴俊玲，高红莉，刘昭纯.马黛茶及有效成分研究概况[J].山东中医杂志，2010，29(9)：650-652.

[5] 王忠华，史姗姗，陈雨，等.浙贝母生物碱提取工艺研究[J].中药材，2010，33(1)：128-132.

[6] 宋玉国，张新茹，李秀芬，等.HPLC测定清咳平喘颗粒中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的含量[J].中国现代中药，2014，16(4)：319-322.

[7] 刘军锋，邵萌，李景源，等.RP-HPLC测定苦木生物碱体外对磷酸二酯酶4的抑制活性[J].中国现代中药，2009，11(3)：30-33.

[8] Mazzafera P.Maté drinking：caffeine and phenolic acid intake[J].Food Chemistry，1997，60(1)：67-71.

[9] Heck C I，De Mejia E G.Yerba Mate Tea (Ilex paraguariensis)：a comprehensive review on chemistry，health implications，and technological considerations[J].Journal of Food Science，2007，72(9)：R138-R151.

DeterminationofCaffeineandTheobromineinMateTea(Ilexparaguariensis)byHPLC

CHENGJing，HUHaifeng*

(SinopharmHealthIndustryInstituteCo，Ltd，ChinaStateInstituteofPharmaceuticalIndustry，Shanghai200040,China)

Objective：An HPLC method was established for simultaneous determination of theobromine and caffeine—two bioactive compounds from Mate Tea (Ilexparaguariensis).MethodsAn Unitary C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)column was used with the mobile phase of methanol and water containing 0.5% of formic acid at the detection wave length of 280 nm and the flow rate of 1.0 mL·min-1.ResultsThe two alkaloids were successfully separated in 30min，and the calibration curves of theobromine and caffeine were linear in the range of 5.010-200.0 μg·mL-1with correlation coefficient of 0.999.The recovery rates were 96.59% and 97.20%，respectively with RSD less than 1.70%.ConclusionThe established method is simple，accurate，sensitive and good repeatability，which can be applied for the quality control of Mate Tea (I.paraguariensis).

Mate Tea (Ilexparaguarienses)；alkaloids；theobromine；caffeine；HPLC

2015-04-13)

*

胡海峰，研究员，博士生导师，研究方向：微生物药物研究与开发；E-mail：haifenghu88@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.8.011