家族遗传性异常纤维蛋白原血症家系的基因型分析

彭新国,于永春,成佳景,刘永云,陈　明,崔艳芳*

(1.滨州医学院附属医院，山东 滨州256603；2.上海第十人民医院)



家族遗传性异常纤维蛋白原血症家系的基因型分析

彭新国1,于永春2,成佳景2,刘永云1,陈明1,崔艳芳1*

(1.滨州医学院附属医院，山东 滨州256603；2.上海第十人民医院)

遗传性无纤维蛋白原血症(inheritdafibrinogenemia)是一种纤维蛋白原基因缺陷引起的常染色体隐性遗传疾病，患者表现为纤维蛋白原完全缺乏，发病率大约为百万分之一。与血友病相比，遗传性无纤维蛋白原患者黏膜出血较严重，但肌肉和骨骼的出血不如血友病常见[1]。第一例异常纤维蛋白原血症基因突变发现于1968年[2]，目前国内外共发现了约400多例遗传性异常纤维蛋白原血症。

纤维蛋白原(fibrinogen,Fg;凝血因子Ⅰ,FⅠ)是一种由2964个氨基酸组成的大分子糖蛋白，以Aα、Bβ、γ三条多肽链为组分，由二硫键构成对称的六聚体结构 (Aα、Bβ、γ)2[3]。三条多肽链分别由3个独立基因FGA、FGB、FGG编码，集中于4q28-4q31约50kb的区域内，从着丝粒到端粒有序的排列[4]。

1　对象和方法

1.1回顾性收集一个遗传性异常纤维蛋白原血症家系的临床资料，根据家系成员实验室检查结果绘制遗传图。如图1所示此家系患者无明显出血症状、无血栓病史。

家系内成员进行编号：先证者编号为S4，先证者的祖母、父亲、母亲、儿子分别编号为S1、S2、S3、S5。正常对照组编号以随机数字表法编号，依次编号为N1、N2、N3-N30。

1.2提取家系成员及对照组外周血约2ml，进行凝血分析。采用promega试剂盒提取外周血DNA和RNA,并对其纯度及浓度进行检测。设计并合成FGA、FGB、FGG基因所有外显子及侧翼序列的引物，PCR反应体系为20ml，以FGA第一外显子为例，反应条件为：94℃，预变性，30min，94℃，变性，30s，60℃，退火，30s，72℃，延伸，50s，72℃，充分延伸，5min，29个循环，扩增先证者及对照组三个基因的所有外显子及侧翼序列，PCR产物纯化后用BeckmanCoulter公司CEQTMGeneticAnalysisSystem基因分析系统测序，测序结果与Genebank中的基因序列比对，部分测序结果如图3。对几个有疑问的错义突变位点利用BeckmanCoulter公司的GenomeLabGeXP系统采用引物延伸法进行基因型分析。

2　结果

先证者纤维蛋白原基因FGA、FGB和FGG的所有外显子及侧翼序列均测通，对测序结果进行分析，没有发现碱基的插入或缺失。外显子区共发现7个单核苷酸突变位点，其中4个错义突变、2个同义突变、一个位于非编码区；内含子区先证者发现1个SNP位点，正常对照也表现为同样的碱基突变。经分析，外显子区的3个错义突变位点为可疑致病突变位点。这三个位点分别为FGGexon8c.902位点、FGAexon1c.16位点和FGBexon8c.1433位点。通过单碱基引物延伸，本次实验选取正常对照30人，在FGGexon8c.902位点上，正常对照组均为纯合子(G/G)，而家系中患者均为该突变位点的杂合子(G/A)，验证了FGG基因第8外显子上的突变是引起家系成员患遗传性异常纤维蛋白原血症的致病突变位点。见下图1-4。

由图可见，患者FGG基因cDNA第902位碱基发生了G→A杂合突变，所编码的氨基酸由原来的精氨酸(Arg)变成了组氨酸(His)，即R275H突变。

图4中前后两峰为marker,分别在13碱基和88碱基的位置。Marker之间的峰，为目的峰，从左到右依次为FGG第8外显子上的碱基突变位点(c.902)、FGA第一外显子上的碱基突变位点(c.16)和FGB第8外显子上的碱基突变位点(c.1433)。正常对照(N1)这三个位点均为纯合子，碱基分别为G、A、G。

图1　家系遗传图谱(箭头所示为先证者S4)

图2　FGA、FGB、FGG基因大部分外显子56℃PCR扩增产物电泳图

图3　FGG基因第8外显子及其侧翼序列PCR产物测序结果

3　讨论

通过单碱基延伸法对有疑问的几个突变位点与对照组进行比较，发现在FGGexon8c.902位点，对照组全部为纯合子G；在FGAexon1c.16和FGBexon8c.1433位点，对照组表现出G/A多态性。可以得出结论：FGG基因第八外显子c.902G>A杂合性碱基置换，导致Arg275His杂合错义突变，是引起该家系遗传性异常纤维蛋白原血症的原因之一，而FGAexon1c.16和FGBexon8c.1433是人类基因多态性位点。方怡等发现FGG基因第8外显子的g.5678G>A杂合碱基置换,而致Arg275His的错义突变是家族性异常纤维蛋白原血症的原因之一[5]。另外赵晓娟等也发现对1个遗传性异常纤维蛋白原血症家系成员位于纤维蛋白原FGA基因上的2号外显子g1233→a杂合碱基改变，导致Arg16His错义突变[6]。

图4　正常对照(N1)三个SNP位点的碱基

本研究家系患者无明显的临床出血症状、无血栓病史。分析原因，可能此家系的纤维蛋白原活性虽然低，但是血管壁、血小板等的功能正常，起到代偿作用。γ链275位氨基酸Arg275His杂合错义突变是引起此家系遗传性异常纤维蛋白原血症的原因，此氨基酸位点上的错义突变，临床表现差异大，ReinCM报道了一个γR275C杂合错义突变的病例，患者表现出严重的出血症状[7]。

遗传性异常纤维蛋白原血症(inheritddisfibrinogenemia)是常染色体显性遗传性疾病，具有很高的外显率，绝大多数是杂合子，约40%无症状。江明华等对8例遗传性异常纤维蛋白原血症先证者分析，发现了p.BβAsn190Ser、p.AαArg35His和p.γArg301His，3个突变所致，提示p.BβAsn190Ser和p.γArg301His可能是国人的热点突变[8]。本实验所研究的遗传性异常纤维蛋白原血症家系，四代4个成员均为遗传性异常纤维蛋白原血症患者，符合常染色体显性遗传的特点

遗传性疾病对人类健康的危害很大，若能发现患病家系的遗传特点，并在基因水平进行诊断和预防，则能提高出生人口的的质量。产前诊断是预防出生缺陷、降低缺陷儿出生的有效措施之一。由于目前对遗传性纤维蛋白原血症无有效的治疗手段。

所以，进行产前诊断的目的就是杜绝纯合子胎儿的出生，减少或预防杂合子胎儿的出生。如能从孕妇体内检测到胎儿的DNA，就可实现无创产前诊断，使从基因水平诊断遗传性纤维蛋白原疾病成为可能。1997年，Lo等首次发现了孕妇血中存在胎儿游离DNA，为无创性产前诊断奠定了基础[9]。Neerman-Arbez等已运用STR位点连锁分析及直接测序的方法进行了首例遗传性无纤维蛋白原血症家系的产前诊断，产前诊断的广泛开展及基因治疗的积极探索将为解决Fg基因缺陷打下坚实的基础[10]。

[1]LakM,KeihaniM,ElahiF,etal.Bleedingandthrombosisin55patientswithinheritedafibrinogenaemia[J].BrJHaematol,1999,107(1):204.

[2]BlombäckM,BlombäckB,MammenEF,etal.FibrinogenDetroit-amoleculardefectintheN-terminaldisulphideknotofhumanfibrinogen[J].Nature,1968,218(5137):134.

[3]MosessonMW,SiebenlistKR,MehDA.Thestructureandbiologicalfeaturesoffibrinogenandfibrin[J].AnnNYAcadSci,2001,936:11.

[4]KantJA,FornaceAJJr,SaxeD,etal.Evolutionandorganizationofthefibrinogenlocusonchromosome4:geneduplicationaccompaniedbytranspositionandinversion[J].ProcNatlAcadSciUSA,1985,82(8):2344.

[5]FangYi，WangXue-feng，FuQi-hua，etal.InheriteddysfibrinogenemiacausedbyArg275Hisintheγchainoffibrinogen[J].ChineseJournalofMedicalGenetics,2005,22(2):1003.

[6]赵小娟，王兆钺，江明华，等.纤维蛋白原α链Arg16His突变导致遗传性异常纤维蛋白原血症[J].中华血液学杂志，2010,31(3):253.

[7]ReinCM,AndersonBL,BallardMM,etal.SeverebleedinginawomanheterozygousforthefibrinogengammaR275Cmutation[J].BloodCoagulFibrinolysis，2010，21(5):494.

[8]江明华，王晓欧，舒旷怡，等.八个遗传性异常纤维蛋白原血症家系的临床和基因突变分析[J].中华医学遗传学杂志，2014,31(2):1003.

[9]LoYMD,CorbettaN,ChamberlainPF,etal.PresenceoffetalDNAinmaternalplasmaandserum[J].Lancet,1997,78(5):350.

[10]Neerman-ArbezM,VuD,Abu-LibdehB,etal.PrenataldiagnosisforcongenitalafibrinogenemiacausedbyanovelnonsensemutationintheFGBgeneinaPalestinianfamily[J].Blood,2003,101(9):3492.

滨州市科技发展计划项目(2013ZC1717)，滨州医学院科技计划项目(BY2011KZ08，BY2013KJ28)

1007-4287(2016)09-1589-03

2015-12-24)