光子晶体水凝胶膜在多元生物分子检测中的应用

刘兆斌

（临沂大学生命科学院，山东临沂 276000）

光子晶体水凝胶膜在多元生物分子检测中的应用

刘兆斌

（临沂大学生命科学院，山东临沂 276000）

我们发展了一种利用单分散硅球的自组装过程中的静电排斥作用形成非密堆积型的光子晶水凝胶膜的方法。通过调节硅球的大小和浓度来形成不同的反射峰来作为载体的编码，利用具有不同反射峰的水凝胶光子晶体膜作为编码载体用作蛋白的多元检测分析。实验证实这种载体适合于多元标记检测，并且具备优异的编码性能和加工性能。

光子晶体水凝胶膜；非密堆积型光子晶体；多元生物检测

自从人类基因组被破解以来，获得更多生物分子信息的要求也不断增加。为了同时区分不同的分析物，应当对分子进行编码。最常见的方法是平面载体技术。这种技术是在平面固相载体上建立二维探针分子（抗体，核酸，药物替代物等）的坐标，对于一种已知靶分子来说每个阵列坐标代表一个探针。平面阵列对于高浓度分子检测具有重要作用，但是结果的好坏和获得结果的速度被平面面积严重制约。近年来，将探针固定在编码载体表面的悬浮阵列在多元分析中成为一种有吸引力的选择。这种阵列对于检测新分析物具有高流动性，由于分析物和探针能更广泛的扩散，悬浮阵列在溶液中显示出更快的反应动力学。目前有很多编码方法，包括使用荧光分子，形状编码，量子点等在这些编码方法中，光谱编码载体由于其编码解码的简便得到了很好的应用。荧光染料和量子点是主要的光谱编码元素，荧光编码的微粒子已经被Luminex和其他公司商业化。然而，荧光染料会发生淬灭和漂白，量子点通常具有生物毒性［1，2］。而且，荧光载体会与标记分子的信号相混合从而影响检测极限。作为一种新的光谱编码载体，光子晶体的编码信号是来自其禁带的特征反射峰［3-7］。由于反射峰来源于光子晶体的周期结构，编码十分稳定而且荧光本底低，使得光子晶体在高灵敏度检测上更加稳定。

本文首次尝试将非密堆积型胶体晶体水凝胶薄膜作为一种光谱编码的载体进行生物分子检测。凝胶薄膜可以提供三维网状结构，从而固定更多的生物分子。此外，高分子水凝胶更具柔性，相比PDMS、PMMA等物质应该具有更好的加工特性，可以期待利用水凝胶锁定有序结构的胶体晶体膜作为编码载体应该具有更好的应用前景。

1　实验和方法

1.1实验材料和仪器

丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺（上海博光生物科技有限公司）；AIBN，实验室自制；无水乙醇；

去离子水：Millipore-Q纯水机，110 nm二氧化硅胶体晶体（日本尼桑公司）；离子交换树脂（美国Biorad公司），扫描电镜：Hitachi S-3000N。

1.2非密堆积型胶体晶体薄膜的制备

将非紧密堆积型二氧化硅胶体晶体用10%（质量体积比）丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺混合液（丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺=29∶1，摩尔比）稀释至为12.3%～18.8%（体积比），加引发剂偶氮异二丁腈（1%，质量体积比）混匀后，通入氮气2～4 min或真空脱气2～4 min，灌入模具中，静置20 min，形成非密堆积型胶体晶体。如图1所示，高压汞灯照射聚合40～60 min，即得胶体晶体凝胶。将胶体晶体凝胶从模具上剥落，用纯水充分洗涤后置于纯水中保存。利用机械的办法将光子晶体水凝胶膜切割成形状规则的1 cm×1 cm的光子晶体膜。

1.3非密堆积型胶体晶体薄膜上的生物分子的固定

将胶体晶体凝胶薄膜切割成边长为1 cm，厚度为0.125 mm的正方形小块。取已知制备好的胶体凝胶薄膜，分别放入不同浓度的戊二醛的PB溶液（0.5%～5%）中4 h后，用PBS溶液洗胶体凝胶薄膜3～5次，除去未反应的戊二醛。然后，固定浓度为10 mg/mL的人IgG分子，过夜反应，反应过后用PBS溶液洗涤光子晶体薄膜3～5次，除去未反应的人IgG分子。加入相同浓度（100 μg/mL）的FITC标记的羊抗人IgG，在37℃下反应2 h后，用PBS进行清洗，然后用荧光显微镜进行荧光信号的检测。

图1　紫外交联非秘堆积型水凝胶光子晶体膜

1.4非密堆积型胶体晶体薄膜上的生物多元检测

用丙烯酰胺浓缩液与SiO2纳米微球制备的光子晶体薄膜，利用机械加工的方式将他们加工成规则的光子晶体薄膜，通过在水凝胶上结合抗体，将标记有荧光的抗原杂交在抗体上。当抗原结合到抗体上时，我们利用胶体晶体膜的反射光谱来编码抗原分子的种类，利用目标分子的荧光来鉴定目标分子的有无。因此我们可以利用水凝胶光子晶体膜来实现多元生物检测。

2　结果和讨论

2.1非密堆积型胶体晶体薄膜的制备

二氧化硅胶体颗粒表面带有负电荷，颗粒间的静电排斥作用使其在溶液中能够保持稳定而不聚集。胶体颗粒通过静电排斥作用自组装形成非紧密堆积型光子晶体。胶体颗粒表面有效电荷、胶体的浓度以及胶体溶液的离子强度是影响颗粒之间静电排斥作用的重要因素，控制这些参数可以控制胶体颗粒的自组装过程。图2所示。胶体颗粒浓度为体积比18.8%时衍射波长为475 nm，随着浓度的减小，晶面间距增加，衍射峰发生红移，浓度减小至12.3%时，衍射峰移至625 nm，体积比继续减小，衍射峰移出可见光范围。

图3是一张扫描电子显微镜图。从图中可以看出胶体颗粒呈六角有序排列，说明制备的胶体凝胶薄膜的质量相当高。

2.2非密堆积型胶体晶体薄膜上的生物分子的固定

IgG分子中有很多可供偶联的官能团，如赖氨酸或末端氨基、天冬氨酸、谷氨酸或末端羧基。由于聚丙烯酰胺和抗体上均有-NH2，而醛基能与氨基发生化学反应，形成希夫碱，所以选择用戊二醛来固定抗体。

图2　二氧化硅非紧密堆积型光子晶体反射光谱

图3　非秘堆积型水凝胶光子晶体膜扫描电子显微镜图

为了方便进行生物检测试验，将胶体晶体凝胶薄膜切割成边长为1 cm，厚度为0.125 mm的正方形小块。取已知制备好的胶体凝胶薄膜，分别放入不同浓度的戊二醛的PB溶液（0.5%～5%）中4 h后，用PBS溶液洗胶体凝胶薄膜3～5次，除去未反应的戊二醛。然后，固定相同浓度（10 mg/mL）的人IgG分子，过夜反应，反应过后用PBS溶液洗涤光子晶体薄膜3～5次，除去未反应的人IgG分子。加入相同浓度（100 μg/mL）的FITC标记的羊抗人IgG，在37℃下反应2 h后，用PBS进行清洗，然后用荧光显微镜进行荧光信号的检测。结果如图4所示。

通过实验结果可以得到，当戊二醛浓度超过4.5%时，胶体晶体凝胶薄膜的荧光信号达到稳定，这说明对于边长为1 cm厚度为0.125 mm的胶体凝胶薄膜而言，在大于4.5%的戊二醛浓度下所进行的化学反应是在饱和状态下进行的，凝胶薄膜上的酰胺基和戊二醛的醛基进行了完全的反应，在醛基饱和的状态下进行的生物分子固定才能充分完全。所以，我们选择4.5%作为固定探针分子的戊二醛溶液浓度。

图4　不同戊二醛浓度浓度下的荧光信号

2.3非密堆积型胶体晶体薄膜上的生物分子的多元检测

采用胶体晶体凝胶薄膜为生物分子检测载体具有很好的优越性，这一点在前言部分已经阐述，在这里就不再赘述。在本实验中，我们采用三种颜色（蓝色，绿色，红色）的边长为1 cm厚度为0.125 mm的正方形胶体晶体凝胶薄膜进行蛋白分子的多元检测实验。取三种颜色（蓝色，绿色，红色）的光子晶体凝胶薄膜，分别固定相同浓度（10 mg/mL）的人IgG，兔IgG，小鼠IgG，以固定小鼠IgG的光子晶体凝胶薄膜作为对照组，过夜反应后用PBS进行充分清洗；将其放入相同试管中加入浓度为100 μg/mL的FITC标记的羊抗人IgG与FITC标记的羊抗兔IgG，放入37℃下反应2 h。取出薄膜，用PBS清洗。反应过后的胶体晶体凝胶薄膜放在倒置荧光显微镜下进行拍照，结果如图5所示。

图5　以胶体晶体膜为载体进行多元生物监测的荧光显微镜图像

由于一抗蛋白分子只能够与其相应的二抗蛋白分子进行特异性结合，而不与其他种类的蛋白分子进行反应，所以我们推测只有固定了人IgG和兔IgG的胶体晶体凝胶薄膜发生了特异性反应，而对照组薄膜上没有发生特异性反应。从图5中可以看出，结果显示只有固定了人IgG和兔IgG的胶体晶体凝胶薄膜在激发后显示出了FITC的绿色荧光，说明了反应的发生，而对照组薄膜上几乎看不到任何绿色荧光。

3　结论

我们利用单分散硅球的自组装过程中的静电排斥作用形成非密堆积型的光子晶体聚丙烯酰胺水凝胶膜。膜用作生物大分子的多元检测载体进行生物检测具有广泛的应用前景。

［1］Trau M，Battersby B J.Novel Colloidal Materials for High-Throughput Screening Applications in Drug Discovery and Genomics［J］.Advanced Materials，2001，13（12-13）：975-979.

［2］Lee H J，Wark A W，Corn R M.Enhanced bioaffinity sensing using surface plasmons，surface enzyme reactions，nanoparticles and diffraction gratings［J］.Analyst，2008，133（5）：596-601.

［3］Rich R L，Myszka D G.Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis［J］.Current Opinion in Biotechnology，2000，11（1）：54-61.

［4］Jiang P，Bertone J F，And K S H，et al.Single-Crystal Colloidal Multilayers of Controlled Thickness［J］.Chemistry of Materials，1999，11（8）：2132-2140.

［5］Fulton R J，Mcdade R L，Smith P L，et al.Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix［TM］system.［J］.Clinical Chemistry，1997，43（9）：1749-56.

［6］Cunin F，Schmedake T A，Link J R，et al.Biomolecular screening with encoded porous-silicon photonic crystals［J］.Nature Materials，2002，1（1）：39-41.

（编辑：晏兵兵）

O657.1

B

1006-799X（2016）17-0089-03

临沂大学博士启动基金（LYDX2013BS032）资助项目

刘兆斌（1978-），男，山东临沂人，讲师，主要从事生化分析的研究工作。