鳗弧菌灭活疫苗对杂交鲟的免疫效果初探

康玉军，杨姣姣，苟彦龙，郑登杰，林光禄，张雪

（甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃兰州 730070）

鳗弧菌灭活疫苗对杂交鲟的免疫效果初探

康玉军，杨姣姣，苟彦龙，郑登杰，林光禄，张雪

（甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃兰州 730070）

以0.5%的甲醛溶液为灭活剂，制备鳗弧菌灭活疫苗，经过无菌和安全试验后，按照2 mL/尾的剂量，通过腹腔注射途径注射浓度为1.78×108cfu/mL的鳗弧菌灭活疫苗对杂交鲟进行免疫；对照组用同等剂量生理盐水处理。免疫7 d后，对试验鱼进行鳗弧菌活菌攻毒。攻毒试验7 d后，计算疫苗的免疫保护率。结果表明，在实验室条件下，0.5%甲醛灭活的鳗弧菌疫苗对杂交鲟安全，免疫保护率为80%。

鳗弧菌；灭活疫苗；杂交鲟；免疫效果

鲟鱼，隶属于硬骨鱼纲（Osteichthyes）辐鳍亚纲（Actinopterygii）软骨硬鳞总目（Chondrostei）鲟形目（Acipenseriformes），是现存的古老生物种群，广泛分布于北半球。鲟鱼肉味鲜美营养价值极高，肉和卵的蛋白含量高达18%和29%。鲟鱼子酱作为高级营养品，更是素有水中“黑黄金”之称。

随着集约化、高密度养殖的迅速发展，鲟鱼养殖生产中细菌性病害问题日益突出，为鲟鱼的养殖造成巨大的经济损失，严重影响了鲟鱼养殖业的发展。针对鱼类细菌性疾病，长期以来，生产实践中多采用广谱抗生素和化学药物进行防治，致使病原菌的抗药性增加，且药物残留对养殖水域生态环境的污染日益严重，另外，水产品中药物残留还会对人体构成潜在的威胁。随着人们对抗菌素等药物使用的安全性日益重视，认识已从以前的“靶动物安全”到“人类食品安全”和“环境安全”。因此开发预防水产病害的相关疫苗，对于水产养殖业的发展和水产品安全具有十分重要的意义。鳗弧菌（Vibrioanguillarum）是一种对水产鱼类危害严重的细菌病原，其流行区域广泛，能引起世界范围内的淡、海水鱼类及其他养殖动物发生弧菌病，给水产养殖业造成巨大的经济损失。目前，已有学者研究报道了鳗弧菌疫苗接种牙鲆、大菱鲆及鲈鱼等的免疫效果研究，而鳗弧菌疫苗免疫鲟鱼方面的研究和应用则未见报道。

本研究以杂交鲟为免疫对象采用鳗弧菌甲醛灭活全菌疫苗，通过腹腔注射进行免疫接种，对其免疫安全性进行了评价，并考察了疫苗接种后的免疫保护率，为鳗弧菌灭活疫苗在鲟鱼养殖生产中的应用提供参考依据。

1　材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试验用鱼试验用杂交鲟购自甘肃省兰州市绿色市场，平均体长30 cm，平均体重500 g。实验开始前在甘肃农业大学水产实验室循环水养殖系统暂养7 d。

1.1.2试验用水曝气3 d的兰州城市自来水。pH值为6.5～7，DO值为6～7 mg/L，水温通过循环冷暖水机控制在18℃左右。

1.1.3试验用菌株试验用鳗弧菌（ATCC 43305）菌株取自西北农林科技大学鱼病学实验室。

1.2试验菌株对杂交鲟的致病性验证

随机取暂养的杂交鲟9尾，平均分为Z1、Z2、Z3三组。将鳗弧菌接种于营养肉汤培养基中，28℃恒温培养24 h后测定菌液浓度并用无菌生理盐水将菌液分别稀释成107cfu/mL和108cfu/mL。对Z1、Z2、Z3三组的试验用鱼分别腹腔注射2 mL/尾的无菌生理盐水、107cfu/mL的菌悬液和108cfu/mL的菌悬液。其他条件与暂养期间保持相同，连续饲养观察7 d，每天观察记录试验鱼的发病及死亡情况。

1.3灭活疫苗的制备

1.3.1菌种的复壮和扩大培养细菌的复壮：先将固体培养基上的鳗弧菌接种到营养肉汤培养基中，之后再于肉汤培养基中连续接种培养3次，达到复壮效果。

菌种扩大培养：将复壮的鳗弧菌接种到500 mL营养肉汤培养基中，在28℃恒温培养24 h。之后，再于5 L营养肉汤培养中继续接种培养24 h，使其种群扩大以获得一定数量的菌种，灭活疫苗制备做好准备工作。

1.3.2鳗弧菌灭活扩大培养的鳗弧菌菌悬液中接种在营养肉汤培养基中，28℃培养24 h后加入终浓度0.5%的甲醛28℃灭活48 h，制得鳗弧菌灭活疫苗。4℃下保存备用。

1.3.3疫苗的无菌检验取上述已制备的0.1 mL鳗弧菌灭活疫苗在普通琼脂平板上涂布，重复3个平板，在28℃条件下培养48 h后观察是否有菌落生长。

1.4疫苗的安全性试验

随机取暂养杂交鲟6尾，平均分为A1、A2两组。按照2 mL/尾的剂量，对A1、A2两组试验鱼分别腹腔注射无菌生理盐水和制备好的灭活疫苗，然后在保持正常饲养条件7 d，观察记录鱼的活动及有无发病情况。

1.5疫苗的免疫效果试验

随机取暂养杂交鲟10尾，分为试验组和对照组，每组5尾鱼。对于试验组，按照2 mL/尾的剂量，通过腹腔注射途径注射浓度为1.78×108cfu/mL的鳗弧菌灭活疫苗对杂交鲟进行免疫；对照组用同等剂量生理盐水处理。免疫7 d后，试验组和对照组的试验鱼，按照2 mL/尾的剂量，同时腹腔注射1.56×108cfu/mL的鳗弧菌菌悬液进行攻毒。注射后7 d内，统计实验组和对照组的发病率，计算疫苗的免疫保护率。

免疫保护率=（对照组发病率-实验组发病率）/对照组发病率×100%。

2　结果

2.1试验用鳗弧菌对杂交鲟的致病性

由表1结果可知，鳗弧菌对杂交鲟成鱼都表现出较强的致病性，试验鱼在人工感染后的3～4 d内发病（后期均死亡），病鱼鳍条基部充血、尾鳍腐烂，内部症状以肝脏坏死为主要特征，常见腹水。当感染剂量为1.78×107cfu/mL以上时，鱼的致病率达到100%。

表1　鳗弧菌对杂交鲟的人工感染结果

表2　鳗弧菌灭活疫苗安全性试验结果

2.2疫苗安全性试验

制备好的0.5%的甲醛灭活疫苗鳗弧菌疫苗在普通琼脂平板上涂布培养24 h后，3个平板上均无菌落生长，可认为细菌全部灭活。对杂交鲟进行腹腔注射灭活疫苗7 d后没有出现发病情况，且活动正常，说明0.5%甲醛灭活的疫苗对试验鱼安全（见表2）。

2.3疫苗的免疫保护率

0.5%甲醛灭活鳗弧菌疫苗免疫试验用杂交鲟的免疫效果结果如表3所示。疫苗免疫7 d后，以鳗弧菌菌悬液腹腔注射对供试鱼进行攻毒。结果显示，对照组试验鱼在攻毒后的3～4 d后发病或死亡，发病（死亡）率为100%，病鱼鳍条基部充血、尾鳍腐烂，内部症状以肝脏坏死为主要特征，多见腹水；而试验组只有20%的发病率，免疫保护率为80%。试验结果表明该疫苗具有较好的免疫效果。

表3　鳗弧菌灭活疫苗免疫效果

3　讨论

本研究中，鳗弧菌灭活疫苗制备完成之后，采取了注射接种的方式对杂交鲟进行了免疫，结果显示具有较好的免疫效果，而疫苗的浸泡免疫效果如何尚未在本研究中涉及。众所周知，注射免疫是效果最好的接种方式，能有效地刺激机体产生相应的抗体。注射免疫有用量少、免疫效果好等特点；但是，由于水产养殖动物生活在水体环境中，对每一个对象逐一进行注射免疫，工作量大、操作要求高，尤其对于鱼种的接种，可行性差。所以，在基于注射免疫效果显著的前提下，下一步很有必要就鳗弧菌灭活疫苗在不同接种方式下对杂交鲟的免疫效果进行比较试验，优化免疫程序和方法，提高疫苗的适用性。

本研究在制备鳗弧菌灭活疫苗时，采用的灭活剂是0.5%的甲醛溶液。甲醛作为动物疫苗灭活剂在国内使用较为普遍，也较为经济、易得，但同时也存在病原体蛋白的抗原性会遭到严重破坏，并可能有病原体存活的不足。β-丙内酯在国外已广泛用于各种疫苗的灭活，与甲醛相比，其价格较为昂贵，但β-丙内酯主要作用于病原体DNA或RNA，通过改变病原体核酸结构达到灭活目的，不直接作用于蛋白，不破坏病原体的免疫原性；同时，β-丙内酯病原时间短，从而可以显著缩短疫苗生产周期，提高经济效益。故而进一步的研究有必要对于不同灭活剂对疫苗免疫效果、经济效益等方面的影响进行综合评价。

水产疫苗早已经被业界公认为是水产养殖病害的最佳防控措施之一，我国水产疫苗的研究开始于20世纪60年代，但是相对于我国水产养殖大国的地位来说其发展却是非常缓慢的。一方面，由于养殖和疾病防治观念落后，在鱼病防治的生产实践中，化学药物的使用远远超过了疫苗；另一方面，我国水产疫苗研究相对滞后，到目前为止我国仅有草鱼出血病活疫苗、草鱼出血病细胞灭活疫苗、鱼嗜水气单胞菌败血症灭活疫苗和牙鲆溶藻弧菌/鳗弧菌/迟缓爱德华菌多联抗独特型抗体疫苗等4种疫苗获得国家新兽药证书，其中获得生产批文的水产疫苗仅有草鱼出血病活疫苗与嗜水气单胞菌灭活疫苗两种。而其他多数产品，仍处于中试或者区域性试验阶段。据不完全统计，目前国际上已有针对20多种水产病原的100多种鱼类疫苗被批准上市，对比国外的情况，我国水产疫苗研发还有很大差距。此外，还需要指出的一点是，无论何种疫苗，从研发到推广应用，从实验室阶段到中试再到转化投产，都需要经过严格而科学地论证，切忌急功近利，匆匆上马。总的来讲，我国水产疫苗研发和推广应用工作都可谓任重而道远。

（编辑：晏兵兵）

S943

B

1006-799X（2016）17-0126-03

甘肃农业大学学生科研训练计划（SRTP）项目（20150416）

康玉军（1988-），男，甘肃张掖人，助教，主要研究方向为水产养殖生物学与病害防治。