口蹄疫病毒RT-PCR快速检测方法的建立

张书光 丁 宏 李乙江 杨 科 普仕华 高花英 李佳赟

（德宏州动物疫病预防控制中心，云南德宏　678400）

口蹄疫病毒RT-PCR快速检测方法的建立

张书光 丁 宏 李乙江 杨 科 普仕华 高花英 李佳赟*

（德宏州动物疫病预防控制中心，云南德宏678400）

目的：建立了一种RT-PCR的方法，用于检测O、A和亚洲I型口蹄疫病原。方法：设计合成一套引物，通过反应条件的优化，建立RT-PCR的方法，以扩增口蹄疫病毒的基因，并用该法检测患病猪的颌下淋巴结和扁桃体，牛、羊的食道-咽分泌物（O-P液）等样品。结果：该方法可快速灵敏检测出猪的颌下淋巴结和扁桃体，牛、羊的食道-咽分泌物（O-P液）中的FMDV，并具有较好的特异性和重复性。结论：建立了一种RT-PCR检测O、A和亚洲I型口蹄疫病原的方法。

口蹄疫病毒RT-PCR快速检测方法

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起如黄牛、猪、绵羊、山羊等偶蹄动物感染的一种热性、接触性、烈性传染病，被国际动物卫生组织列为A类重要传染病之首。该病的发生和流行严重危害畜牧业的健康持续发展，造成巨大的经济损失，因此世界各国相当重视对该病的研究和防治。该病对畜牧业生产危害性极大，是世界各国检疫和防疫的重点对象。

德宏州地处云南滇西边境，与缅甸毗邻，边境线全长503.8km，边境线无人工和天然屏障，中缅贸易相互往来，牧场共用。全州有两个国家一类口岸，两个二类口岸，28个渡口，64条通道，是我国东南亚的主要窗口和重要枢纽。随着经济的发展，从境内、外输入我州的偶蹄动物数量不断增加，在我州进行短期育肥后屠宰再进行贸易和消费，从而对我州的动物疫病防控带来了极大风险。因此口蹄疫病毒RT-PCR检测方法的建立已迫在眉睫。

1　材料与方法

1.1阳性病料和引物设计、合成

阳性病料和O、A和亚洲I型检测引物由云南省动物疫病预防控制中心提供。引物扩增片段大小为450bp。

1.2仪器设备、酶和试剂盒

核酸自动提取仪NP968-S（西安天隆），震动球磨仪GT200（格瑞德曼），PCR仪（德国耶拿），Syngene凝胶成像系统（美国UVP），Ex-DNA/RNA病毒核酸提取试剂盒（西安天隆），PrimeScript™ One Step RT-PCR Kit（TAKARA）。

1.3总RNA的提取

分别应用西安天隆科技有限公司生产的Ex-DNA/RNA病毒核酸提取试剂盒和从猪的颌下淋巴结和扁桃体，牛、羊的食道-咽分泌物（O-P液）中提取总DNA/RNA，具体操作过程见说明书。

1.4RT-PCR

RT-PCR体系：

Enzyme　Mjx　2μl 2×1 Step Buf fer 　25μl上游引物（20 μM） 　1μl（0.4μM/μl）下游引物（20 μM） 　1μl（0.4μM/μl）提取的总RNA 　1μl RNa s e F r e e d H 2O 　Up t o 5 0?μl

反应条件：

50℃30 min

94℃2 min

94℃30 sec

55～65℃30 sec25～30 Cycles

72℃1 min/kb

1.5PCR 产物的检测

取5～10μl扩增产物于1%琼脂糖凝胶（含0.5%μg/m l 花青素）。配胶及电泳缓冲液均为1×TAE（0.04mol/L Tris-乙酸，0.001mol/L EDTA，pH8.0），200V电泳30～40min，在凝胶成像系统内观察PCR产物在凝胶中的位置，以DL2，000DNA Marker为参照物，确定扩增产物的分子量，判定结果。

2　结果

2.1样品处理

口蹄疫病毒的嗜好组织为：猪的颌下淋巴结和扁桃体，牛、羊的食道-咽分泌物（O-P液）。样品处理的好坏直接会影响到核酸的提取效果。目前常用的方法是组织研磨磨碎后反复冻融，12000rpm离心5min取上清，牛、羊的食道-咽分泌物（O-P液）直接12000rpm离心5min取上清。由于手工研磨费时费力，本实验主要对组织提取方法进行比对，采用震动球磨仪GT200自动研磨和手工研磨两种方法，结果如下：

自动研磨和手工研磨　耗费时间球磨仪　2mjn/24份+1mjn/份手工　3mjn/份

当样品≤8时，直接用人工研磨的更加快速。当样品数＞8时，震动球磨仪GT200研磨出的样品比人工研磨的更加快速。

2.2RNA提取方法的建立

目前常用的核酸提取方法包括手工提取法（吸附柱法）和核酸自动提取仪提取法（磁珠法），将两种方法提取的核酸电泳检测比对发现两种方法均可以提取出较高质量的RNA，均符合本实验要求。

手工和核酸自动提取仪RNA提取效果图

从左到右依次为：Marker、手工1号RNA、手工2号RNA、自动提取仪1 号RNA、自动提取仪2号RNA

O、A和亚洲I型三对引物梯度PCR效果图

从左到右依次为：Marker、55（O、A、亚洲I）、57（O、A、亚洲I）、58（O、A、亚洲I）、59（O、A、亚洲I）和60℃（（O、A、亚洲I））2.3RT-PCR 方法的建立

为了确定O、A和亚洲I型三对引物的退火温度，分别对三对引物进行了梯度PCR扩增，通过几轮梯度PCR，比较结果发现O、A和亚洲I型三对引物的最佳退火温度均为60℃。

3　讨论

目前常规检测 FMD 的技术主要有动物接种、病毒分离和血清学试验等方法，上述方法有的费时长达几天至数周（如动物接种）、有的需细胞培养等条件（如血清中和试验）、有的存在非特异性反应（如荧光抗体试验）和敏感性低（如琼扩）等缺点。这些方法难于满足口岸动植物检疫部门及基层兽医检疫部门对进出口动物、畜产品（主要是肉、奶等）、痊愈动物带毒及亚临床感染的检测。因此，我们建立了一种可快速准确检测FMDV的RTPCR 技术。

目前RT-PCR检测 FMD 的技术主要环节为样品处理、核酸提取和稳定的检测引物三个方面。本实验对三个环节均进行了大量的摸索，发现震动球磨仪GT200研磨出的样品1500转3min可以将组织均匀打碎，有利于实验结果的重复性和可参比性。核酸自动提取仪提取法（磁珠法），可以提取出较高质量的RNA，鉴于磁珠法方便快捷全自动，半个小时可以完成32份样品的核酸提取，因此磁珠法更适用于各州市县动物疫控中心的大批量监测。

试验结果表明，O、A和亚洲I型三对引物的最佳退火温度均为60℃，使用该退火温度，检测条带清晰明亮，可有效避免假阳性和假阴性的实验结果出现，同时，为了质控标准，可在实验时做阴阳性对照，阳性对照可用商品弱毒疫苗提取核酸，阴性对照可用双蒸水。