超高效液相色谱-质谱联用法（UFLC -MS/MS）测定山楂片中展青霉素含量的研究

赵红磊杨丽蓉赵红艳

（1.潍坊市食品药品检验检测中心 山东潍坊 261201；2.滨州医学院 山东烟台 264003）

超高效液相色谱-质谱联用法（UFLC -MS/MS）测定山楂片中展青霉素含量的研究

赵红磊1杨丽蓉1赵红艳2

（1.潍坊市食品药品检验检测中心 山东潍坊 261201；2.滨州医学院 山东烟台 264003）

建立了超高效液相色谱-质谱联用仪（UFLC-MS/MS）测定山楂片中展青霉素含量的方法。山楂片样品经粉碎后酶解，以乙酸乙酯提取展青霉素，用HLB固相萃取小柱净化并浓缩，以UFLC-MS/MS电喷雾离子源负离子（ESI-）多反应监测模式（MRM）检验。方法线性相关系数0.9996，检出限5μ g/kg，加标回收率81.34～96.4%，相对标准偏差1.7%～4.6%。结果表明，方法简便、快速、准确，能应用于山楂片中展青霉素含量的测定。

超高效液相色谱-质谱联用 展青霉素 山楂片

展青霉素（Patulin），化学名称为4-羟基-4氢-呋喃-［3，2c］-吡喃-2（6）-酮［1］，化学式C7H6O4，分子量154，属杂环内酮结构。展青霉素首先在霉烂苹果和苹果汁中发现，广泛存在于各种霉变水果中。展青霉素是由曲霉和青霉等真菌产生的一种次级代谢产物， 具有影响生育、致癌和免疫等毒理作用，同时也是一种神经毒素。使人神经麻痹、肺水肿、肾功能衰竭［2］［3］。在食品检验中，常在苹果和山楂制品中发现，是判断该类产品是否安全的一个重要指标［4］。

鉴于展青霉素潜在的毒性及危害性，大多数国家和组织已建立了展青霉素的限量标准，如欧盟规定苹果汁及含苹果汁的饮料中展青霉素最大限量为 50μg/kg，WHO 规定展青霉素在苹果汁中的最高限量标准为 50μg/kg［5］；我国对展青霉素的限量也作了规定，GB2761-2011《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》规定以苹果及山楂为原料制成的产品中（果丹皮除外）展青霉素限量为50μg/ kg。目前我国的展青霉素检验标准为薄层色谱法（GB/T5009.185-2003《苹果和山楂制品中展青霉素的测定》）以及液相色谱法（NY/ T1650-2008《苹果及山楂制品中展青霉素的测定高效液相色谱法》）两种。薄层色谱法在实际检验过程中操作繁琐，重复性差，液相色谱法则存在羟甲基糠醛的干扰，影响展青霉素的测定，存在假阳性的可能。目前文献报道中采用的检测方法还有气相色谱法、气相色谱-质谱联用法、免疫学检测方法等［4，6］。本文在前人研究的基础上，研究建立了山楂片及制品中展青霉素的超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS/MS）检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器

超高效液相色谱-质谱联用仪（液相为Shimadzu UFLCXR，质谱为美国AB公司

API4000+），分析天平 （XS205DU，梅特勒-托利多），食品粉碎机（屹立QE-100），涡旋混匀器 （IKA MS3 ），氮气吹干仪（海能HN200），离心机（Thermo F16），pH计（梅特勒-托利多）。

1.2 试剂及耗材

乙腈、乙酸乙酯、冰乙酸（均为色谱纯 ），果胶酶（Sigma公司），展青霉素标准品（98.8%，Pribolab公司），Oasis HLB柱（3mL/60mg，美国Waters公司）、山楂制品样品来自市场购买。

1.3 标准溶液的配制

精密称取适量展青霉素标准品于容量瓶中，用适量乙酸乙酯溶解后，加乙酸乙腈定容到刻度，配制成100μg/mL的标准储备溶液，避光保存于-20℃冰箱中。准确移取适量的展青霉素标准储备溶液于，氮气吹干后用0.2%乙酸配制成1μg/mL的标准中间溶液，避光保存于4℃冰箱中。使用时，根据需要以空白基质溶液稀释成适当浓度的标准使用溶液，标准使用溶液应临用前配制。

1.4 样品前处理

1.4.1 提取

确称取5g均匀试样（精确到0.01g） 于50mL具塞刻度试管中，加入20mL水与100μL果胶酶溶液，40℃避光放置2h酶解。在酶解后溶液中加入20mL乙酸乙酯，涡旋震荡提取后，于6000rpm离心3min，转移上层乙酸乙酯提取液，再用20mL乙酸乙酯重复提取一次，收集两次的乙酸乙酯溶液，40℃氮气吹干后，用适量1%乙酸溶液溶解残渣，并转移至10mL容量瓶中并定容，待下一步净化处理。

1.4.2 净化

Oasis HLB柱首先用6mL色谱甲醇和6mL水活化，然后准确移取5.00mL上述样品溶液（1.4.1）置于活化过的HLB柱内，使之以3mL/min的速度流过HLB柱，以乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液并用氮气吹干，然后用1.00mL 0.2%乙酸溶液溶解残渣，过0.22μm滤膜后上机。

1.5 试验方法

1.5.1 液相色谱条件

液相色谱柱1 （Shim-pack XR-ODS， 2.0×75mm，2.2μ m），液相色谱柱2（Shim-pack XR-ODS， 2.0×100mm，2.2μm），液相色谱柱3（BEHC18， 2.1×100mm，1.7μm）。流动相：乙腈+水（10+90）；流速：0.20mL/ min，柱温：35℃。进样量：10μL。

1.5.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源ESI；扫描方式：负离子模式；检测方式：多反应监测MRM，利用保留时间和离子丰度判断定性结果， 利用峰面积定量；喷雾电为-4500V；离子化温度450℃；碰撞气5；气帘气10；雾化气13；辅助气13；定量离子对m/z 152.8/108.8；定性离子对m/z 152.8/134.7；去簇电压DP：-36；射入电压EP：-6；碰撞电压CE：-18；碰撞室射出电压CXP：-15。

图1 展青霉素二级质谱图Fig.1 MS/MS spectrum of patulin

表1 不同色谱柱对展青霉素的分离能力比较Table1 separation effects of patulin by different chromatography columns

表2 精密度和准确度考察结果Table2 Results of precision and accuracy

图2 50 μg/L展青霉素标准品UFLC-MS/MS分离图左图为m/z108.8，右图m/z134.7Fig.2 UFLC-MS/MS spectrum of patulin with concentration of 50 μg/L Left is m/z108.8， right is m/z108.8

图3 阳性样品中展青霉素UFLC-MS/MS分离图左图为m/z108.8，右图m/z134.7Fig.3 UFLC-MS/MS spectrum of patulin in hawthorn tablets Left is m/z108.8， right is m/z108.8

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的选择

根据展青霉素的性质，其具有较强的电负性，因此在负离子模式下，对其进行检测。采用针泵进样的方式对质谱条件进行优化。首先用针泵进样1μg/mL展青霉素标准溶液，流速10μL/min，找准其母离子m/z 152.8，调整CE电压使母离子峰高约为最大子离子峰高的1/3至1/4，同时确定其子离子碎片m/z 108.8、m/z 134. 7，以m/z 152.8/108.8为定量离子对，以m/z 152.8/134.7作为定性离子对（见图1）。

2.2 色谱条件的选择

展青霉素属于强极性化合物，同时其分子量较低，因此本试验采用常用的C18柱对展青霉素进行分离，分别考察了不同C18柱Proshell 120 SB-C18、Inertsil ODS-3、BEH C18分离能力，结果发现不同C18柱分离效果都能达到要求，出峰时间有所差别，综合选择了出峰时间较晚，峰宽最窄的Inertsil ODS-3色谱柱。

由于展青霉素的强极性，为了保证较好的分离洗脱，因此试验选择极性较低的乙腈作为流动相，同时将乙腈的比例设置为较低比例10%，结果发现该条件对展青霉素的分离有较好的效果。同时由于展青霉素在酸性条件下较为稳定，因此本试验选择0.2%乙酸溶液为溶剂对样品进行定容。

2.3 灵敏度和检出限

试验对该方法的灵敏度和检出限进行了考察，灵敏度以标准曲线回归方程考察。用空白样品处理液稀释展青霉素标准中间溶液，得到浓度为10μg/L、20μg/L、30μg/L、40μg/L、50μg/L、100 μg/L标准系列，以峰面积为Y轴、浓度为X轴进行线性回归得到标准曲线方程Y=151.5x-55.7，r2=0.9996，线性相关性良好。

取空白样品处理液添加适当浓度展青霉素标准溶液后进样，按3倍信噪比S/N计算得出其最低检测限为5μg/kg，而我国国家标准规定的展青霉素的限量为50μg/kg，此方法完全能满足需要。

2.4 精密度和准确度

取不含展青霉素的空白样品进行加标试验，分别添加至10μg/ kg、30μg/kg、50μg/kg三个水平进行试验，以回收率考察方法的准确度，同时每个水平进6针作平行测定，以相对标准偏差（RSD）考察方法的精密度。试验结果见表。

2.5 实际样品测试

根据本文确定的试验方法，我们从市场上购买了10份山楂片样品进行检测，其中有一份样品检出阳性，检出展青霉素含量为13.2 μg/kg。阳性样品色谱图见图。

3 结果和讨论

本文通过开展系列试验研究，考察了不同色谱柱对展青霉素的分离能力，通过优化质谱条件，确定了展青霉素的定性和定量离子对，从而能对展青霉素进行确证性检测，考察了方法的灵敏度、检出限、精密度和准确度，同时对实际样品进行检验，结果表明该方法能够快捷准确的对山楂片中的展青霉素进行检测，能较好的满足检验需求。

［1］徐明悦，李洪军，王珊等.食品中展青霉素检测方法及脱除技术研究进展［J］.食品工业科技，2015，36（01）：375-380.

［2］周克权.展青霉素的化学检测方法［J］.国外医学卫生学分册，2001，28（1）：29-32.

［3］周玉春等.展青霉素的研究进展［J］.贵州农业科学，2010，38（2）：112-116.

［4］刘功良，陶嫦立，白卫东，赵文红.农产品中展青霉素检测的研究进展［J］.安徽农业科学，2011，39（10）：6084-6092.

［5］毛艳玲，蔡艳等.苹果中展青霉素的气相色谱-质谱检测研究［J］.核农学报，2015，29（9）：1757-1765.

［6］王娅芳，刘利亚，黄培林.展青霉素检测方法及污染情况的研究进展［J］. 现代预防医学，2012，39（19）：5116-5223.

Research of content determination of patulin in haw flakes by UFLC-MS/MS

Honglei Zhao1， Lirong Yang1， Hongyan Zhao2
（1 Weifang Center for Food and Drug Control， Weifang 261201， China）（2 Binzhou Medical University， Yantai264003， China）

A method was developed for content determination of patulin in haw flakes by UFLC-MS/MS. Haw flakes samples were enzymed after crushed，then patulin was extracted by ethyl acetate， purified by HLB solid-phase extraction column， and determined by UFLC-MS/MS with electrospray negative ionization （ESI-） in multiple reaction monitoring （MRM）. Good Linear correlation coefficient 0.9996 was observed. Detection limit of the method was 5μ g/kg. The recovery rate of patulin added was 81.34% ～ 96.4% with the relative standard deviation from 1.7% to 4.6%. The results showed that the method is simple，fast and accurate， and could be applied on content determination of patulin in the hawthorn tablets.

UFLC-MS/MS； patulin； haw flakes

R917

A

1674-2060（2016）02-0016-03

赵红磊（1985-），男，工程师，主要从事食品检验方面的研究。