杀虫单对不同倍性泥鳅鳍细胞系的毒性作用

向阳，李霞,2,*，秦艳杰，单莉娟，杨艳津

1.大连海洋大学辽宁省海洋生物资源恢复与生境修复重点实验室,大连116023

2.大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室,大连116023

杀虫单对不同倍性泥鳅鳍细胞系的毒性作用

向阳1，李霞1,2,*，秦艳杰1，单莉娟1，杨艳津1

1.大连海洋大学辽宁省海洋生物资源恢复与生境修复重点实验室,大连116023

2.大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室,大连116023

以泥鳅鳍二倍体(DIMF)和三倍体(TRMF)细胞系为受试细胞，研究杀虫单对2种细胞系的毒性作用。采用噻唑蓝(MTT)法测得DIMF与TRMF 24 h半致死浓度分别为119.73 mg·L-1、146.26 mg·L-1。DIMF的敏感性明显高于TRMF。经杀虫单处理的活体细胞表现为细胞伸长，空泡化和脱落并游离于培养基表面的现象。2种细胞系酶活力测定的结果显示：杀虫单浓度为0～100 mg·L-1时，SOD和GST活力随着浓度的增加而增加，100～200 mg·L-1浓度组酶活力逐渐降低；0～200 mg·L-1时，AChE活力与杀虫单浓度呈负相关，并且三倍体3种酶活力均高于二倍体。微核试验结果显示：50 mg·L-1杀虫单就能对细胞核造成损伤并形成微核，微核率随杀虫单浓度增加而增加。当杀虫单浓度达到200 mg·L-1时，微核率出现最大值，DIMF和TRMF分别为3.3‰和3.7‰，2种细胞的测试结果无显著性差异(P＞0.05)。电镜观察结果显示：对照组DIMF和TRMF超微结构无明显差异；DIMF和TRMF病理变化情况相似：染色质凝集趋边，细胞核分解成多个，细胞内出现空泡和凋亡小体，表现出凋亡的特征。研究表明杀虫单的细胞毒性机制是通过改变细胞内酶活性从而诱导凋亡，不同倍性细胞系之间的差异主要与多倍体细胞体积大，胞内物质多，分裂快，生长旺盛等有关。

杀虫单；泥鳅鳍细胞系；二倍体；三倍体；酶活力；微核率；超微结构；凋亡

向阳,李霞,秦艳杰,等.杀虫单对不同倍性泥鳅鳍细胞系的毒性作用[J].生态毒理学报,2016,11(3):308-315

Xiang Y,Li X,Qin Y J,et al.In vitro cytotoxicity test of monosultap using different ploidy loach fin cell lines[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016, 11(3):308-315(in Chinese)

农药的使用，虽然给农业的增产增收提供了保障，却给水生生物以及人类健康带来了严重威胁[1]。相关农药毒性研究较多是利用鱼类个体开展的，近年来利用鱼类细胞系的进行农药及海洋污染物的毒性研究越来越受到重视。陆续报道的有褐色大头鲶BB细胞系[2]、虹鳟RTG-2细胞系[3]、鲈鱼心脏细胞系[4]、真鲷鳍细胞系[4]、牙鲆鳃细胞系[5]、褐点石斑鱼鳍细胞系[6]、大黄鱼鳍细胞系[7]等用于农药及海洋污染物的毒性分析。杀虫单(monosultap)化学名称1-硫代磺酸钠基-2-二甲氨基-3-硫代磺酸基丙烷，是一种对昆虫具有触杀和胃毒作用的人工合成沙蚕毒类杀虫剂[8]，主要用于水稻害虫的防治。目前较多报道是杀虫单在环境中残留的检测方法[9-10]，而利用细胞系对杀虫单的检测尚未见报道。

泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)作为一种环境污染指示生物，具有对农药敏感的特点，成为毒理学研究较为理想的实验材料[11-13]。泥鳅毒理学研究多集中于重金属、农药等的毒性效应[13]。已有报道如Hg、Cu、Pb和Zn四种重金属对泥鳅胚胎发育与仔鱼成活影响的研究[14]，甲胺磷与敌枯双对泥鳅红细胞微核的诱导的影响[15]等。而关于杀虫单对泥鳅毒理学的研究鲜见报道。本文采用实验室建立的泥鳅鳍二倍体和三倍体细胞系为实验材料，研究了杀虫单对其存活率、细胞形态、酶活力、微核率和超微结构损伤的影响。目的是探讨杀虫单的细胞毒性机制，从而建立杀虫单农药的体外毒性检测体系。

1 材料与方法（Materials and methods）

1.1 实验材料

实验所用的60-70代泥鳅鳍二倍体细胞系(DIMF)和三倍体细胞系(TRMF)由大连海洋大学细胞工程实验室2012年建立。细胞在含20%胎牛血清DMEM/F12培养基中培养(25℃、5%二氧化碳培养箱)。

实验所用的90%杀虫单可溶性粉剂购于西华农药厂。DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、胰酶均为Hyclone公司产品。MTT粉、二甲基亚砜(DMSO)购置于上海生工。超氧化物歧化酶(SOD)、乙酰胆碱酯酶(AChE)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.2 实验方法

1.2.1 实验设计

在超净工作台上取对数生长期、状态良好的60-70代DIMF细胞和TRMF细胞，用0.25%的胰酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞密度为1×105个· mL-1，以每孔100 μL接种于96孔板或等密度接种5 mL到25 mL细胞培养瓶中，培养24 h后，弃掉原培养基。在预实验中，已确定浓度达到350 mg·L-1时二倍体与三倍体细胞全部死亡，故设置杀虫单浓度梯度0、50、100、150、200、250、300、350 mg·L-1，每个浓度设置5个重复，用于MTT检测。培养瓶中加入5 mL浓度为0、50、100、150、200 mg·L-1杀虫单，用于酶活性、微核的研究。以上细胞均在CO2培养箱(5%，25℃)中培养24 h。

1.2.2 杀虫单对泥鳅鳍细胞系毒性作用的MTT检测

按照1.2.1方法染毒24 h后，加入20 μL的5 mg·L-1MTT溶液于96孔板中，25℃孵育4 h，弃掉培养基，用预热到37℃磷酸缓冲液(PBS)轻轻快速清洗2次，每孔加入150 μL DMSO溶解甲臜溶液，室温震荡10 min，在酶标仪492 nm波长下测各孔吸光值，计算其平均值。

细胞存活率计算公式：细胞存活率=(处理组吸光度值-空白对照组吸光度值)/(阴性对照组吸光度值-空白对照组吸光度值)×100%。

1.2.3 杀虫单对泥鳅鳍细胞系超氧化物歧化酶(SOD)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、谷胱甘肽S转移酶(GST)活性检测

按照1.2.1方法染毒，培养24 h后，用胰酶消化并收集细胞培养瓶中的细胞，1 500 r·min-1离心l0 min，将沉淀用PBS重悬后，在冰浴中用超声波破碎仪破碎细胞(工作3 s，间隙3 s，处理10 min)，将破碎后的细胞悬液于2 000 r·min-1，4℃离心10 min，离心收集上清液，分别按照试剂盒说明书进行酶活力测定。

1.2.4 细胞微核率的测定

按照1.2.1染毒方法处理细胞24 h后，胰酶消化并收集培养瓶中的细胞，1 000 r·min-1离心5 min，去上清，用0.5 mL PBS重悬细胞。将细胞滴于干净的载玻片上，采用45°推片的方法快速推片，甲醇固定10 min，用Giemsa染液(PBS:Giemsa 9:1)染色5 min，蒸馏水冲洗，晾干，镜检。每个片计数1 000个细胞以上，记录微核细胞数。微核率=有微核的细胞数/观察到的细胞总数×1000‰。

1.2.5 电镜样品制备及观察

取对照组和半致死浓度组的DIMF和TRMF细胞，用胰酶处理细胞并收集在离心管中，1 500 r· min-1离心10 min，去上清，加入3%戊二醛固定，4℃固定6 h以上。弃去固定液，固定好的样品用PBS漂洗3次，每次5 min。再用1%锇酸于4℃固定1.5 h，然后用乙醇系列脱水，用环氧树脂Epon812对样品包埋后切片，超薄切片经醋酸双氧铀和柠檬酸各染色30 min，置于HITACHI-600透射电镜下观察拍照。

1.3 数据处理

用SPSS 17.0软件分析处理数据。使用t-test进行组间显著性差异分析，实验结果用平均值±标准误表示，P＜0.05表示显著差异，P＜0.01表示极显著差异。

2 结果（Results）

2.1 杀虫单对DIMF和TRMF细胞存活率的影响

图1给出了不同浓度杀虫单处理DIMF和TRMF细胞24 h后的存活率曲线。从图中可以看出2种细胞变化规律基本一致。细胞存活率与浓度自然对数间呈现良好的线性关系，其回归方程分别为：y=-56.981x+322.67(R2=0.9871)，y=-48.845x+ 293.51(R2=0.9810)，计算得出DIMF和TRMF 24 h半致死浓度分别为119.71 mg·L-1、146.26 mg·L-1。50 mg·L-1杀虫单即可引起细胞死亡，此时两者的存活率分别为95.89%与97.93%，随着浓度的增加，其存活率逐渐降低，且存在明显的浓度依赖性。当杀虫单浓度达到300 mg·L-1时，二倍体全部死亡，当浓度达到350 mg·L-1时，三倍体全部死亡。总体来看，二倍体各浓度组死亡率比三倍体要高一些。

图1 杀虫单对泥鳅鳍二倍体细胞系（DIMF）和三倍体细胞系（TRMF）存活率的影响

2.2 杀虫单处理DIMF与TRMF细胞的光镜观察结果

在倒置显微镜下观察染毒后细胞的变化，正常细胞排列紧密，呈纤维样，贴壁生长(图2A，D)。染毒24 h后细胞出现明显的形态学变化，二倍体和三倍体细胞变化一致。100 mg·L-1杀虫单浓度组部分细胞胞体伸长呈线状，200 mg·L-1杀虫单浓度组中多数细胞胞体伸长，细胞轮廓模糊，有些细胞内出现空泡或脱离培养瓶壁，悬浮在培养液中(见图2B，E)，当杀虫单浓度达250 mg·L-1时多数细胞变圆脱落、贴壁的很少(见图2C，F)。

图2 不同浓度杀虫单处理后泥鳅鳍DIMF与TRMF的形态变化

2.3 杀虫单对泥鳅鳍细胞系酶活性的影响

2.3.1 杀虫单对细胞系SOD的影响

图3为不同浓度杀虫单处理DIMF和TRMF细胞24 h后的SOD活力图，50 mg·L-1杀虫单浓度组引起了SOD酶活力增加，100 mg·L-1杀虫单浓度组SOD活性最高，和对照组比较差异显著(P＜0.05)，以后随浓度升高酶活性降低，各浓度组三倍体细胞系酶活力均高于二倍体细胞系(P＜0.05)。

图3 不同浓度杀虫单处理后泥鳅鳍DIMF和TRMF的SOD酶活力

图4 不同浓度杀虫单处理后泥鳅鳍DIMF和TRMF的AChE酶活力

2.3.2 杀虫单对细胞系AChE的影响

在0～200 mg·L-1时，在二倍体与三倍体AChE酶活力与对照组比均显著性降低(P＜0.05)，并具有浓度依赖性。但三倍体酶活力均高于二倍体细胞(P＜0.05)。

2.3.3 杀虫单对细胞系GST的影响

杀虫单处理24 h后，50 mg·L-1浓度组并未引起二倍体GST活性的显著变化。当浓度达100 mg· L-1时酶活力显著升高，达到最大值，与对照组比较差异显著，(P＜0.01)，随着杀虫单浓度增加酶活性又逐渐降低，各浓度组三倍体细胞系酶活性均高于二倍体细胞系(P＜0.05)。

图5 不同浓度杀虫单处理后泥鳅鳍DIMF和TRMF的GST酶活力

2.3.4 杀虫单对细胞系微核率的影响

杀虫单处理后的DIMF与TRMF均出现微核，两者的变化规律较一致，微核出现在细胞质中，呈圆形且边缘光滑，与细胞核染色一致，如图6A、B所示。由表一可知，经杀虫单处理后DIMF和TRMF微核率与对照组比较有显著提高，当浓度达到200 mg·L-1时，两者的微核率最大，分别为3.3‰和3.7‰，分别为对照组的10倍和11.2倍。随着浓度增加，在同一浓度下，二倍体与三倍体之间微核率差异不显著(P＞0.05)。

图6 杀虫单处理后泥鳅鳍DIMF（A）与TRMF（B）细胞核的形态

表1 不同浓度杀虫单对泥鳅鳍DIMF和TRMF微核率的影响Table 1 The effect of different concentrations of monosultap on the micronucleus rates of loach fin DIMF and TRMF

2.4 杀虫单对细胞超微结构的影响

对照组中DIMF细胞形态规则，有明显可见的核，核膜完整，细胞核边界明显，粗面内质网结构完整，有大量线粒体。TRMF细胞形态结构与DIMF相似，只是核体积较DIMF大，细胞中空泡较多。(见图7A，B)。经半致死浓度杀虫单处理的细胞，DIMF和TRMF病理变化一致，细胞超微结构发生明显改变：细胞核分解成多个，线粒体、核糖体与内质网等细胞器消失(见图7C)，细胞内出现大量空泡(见图7D)，出现凋亡小体(见图7E，F)，表现出凋亡的特征。

图7 杀虫单处理后泥鳅鳍DIMF和TRMF超微结构变化

3 讨论（Discussion）

杀虫单可引起细胞形态发生较大变化。正常的泥鳅鳍细胞为成纤维样，贴壁生长。低浓度杀虫单处理的泥鳅鳍细胞表现出细胞伸长，透明度降低等早期变化，随着杀虫单浓度的增加，细胞表现为空泡化，颗粒样物质增多，细胞间空隙加大，最后脱离培养瓶底等晚期变化。作者认为泥鳅鳍细胞系早、晚期形态的改变等特征可作为环境中杀虫单的检测指标。超微结构变化显示经杀虫单处理的DIMF和TRMF细胞，细胞核分解成多个，同时细胞内出现大量空泡，并伴随着凋亡小体产生，上述变化符合细胞凋亡的特征[16-17]。殷立成和郭华荣[5]在探讨丁草胺对牙鲆鳃细胞系急性毒性作用中发现细胞形态的改变与细胞内抗氧化系统活性有直接的关系。Peikert等[18]在研究呼吸道上皮细胞的凋亡和脱落与诱发哮喘之间的关系时发现，SOD的活性与呼吸道上皮细胞脱落或凋亡的发生呈线性关系，也即是说SOD活性增加时能够保护细胞不致脱落或凋亡。本实验中100～200 mg·L-1浓度组，随杀虫单浓度的增加，SOD酶活力逐渐降低，证明细胞结构的变化与SOD活性有关。GST作为生物体重要的解毒酶，可催化脂溶性物质的甲基与谷胱甘肽(GSH)结合，来降低农药对细胞的损伤。过高的杀虫单浓度会造成细胞自身抗氧化能力不足，导致氧化酶系统损伤，同时抑制AChE酶活性，使细胞不能及时地对外界刺激做出反应，还能将底物GSH耗尽，细胞内GST无法诱导，使细胞表现出一系列的急性中毒症状[19-22]。所以杀虫单的细胞毒性机制是破坏细胞的代谢平衡和内部结构，导致细胞生长与增殖停滞，使细胞内酶活性改变从而诱导细胞凋亡，最终导致细胞死亡。

微核是药物作用于分裂期细胞的纺锤体，使染色体断裂、丢失、结构破坏[23]而产生的。楼允东和吴萍[15]在研究甲胺磷和敌枯双2种农药对泥鳅红细胞微核影响时发现在一定浓度范围内，微核细胞率与农药浓度呈正相关。本实验中50 mg·L-1杀虫单就能对细胞核产生损伤，形成微核，而且微核率随杀虫单浓度增加而增加，在200 mg·L-1时，微核率出现最大值。农药能诱导细胞DNA损伤，但氧化损伤对微核的形成影响较小[24]。DNA损伤导致细胞有丝分裂时染色体发生断裂，在细胞间期丧失着丝粒的染色体片段滞留在主核外形成微小染色质块。当农药作用后，诱导细胞DNA损伤，但DNA通过合成与修复作用，损伤部位能得到快速修复，另一方面，氧化剂主要是导致DNA单链断裂，损伤的正确修复率大大提高，并且DNA单链断裂对微核的形成影响很小。微核率检测对揭示农药对水生生物体的潜在危害及作用本质具有重要意义，可以将微核率作为检测杀虫单对细胞损伤的指标。

（References）：

[1] 杨先乐,湛嘉,黄艳平.有机磷农药对水生生物毒性影响的研究进展[J].上海水产大学学报,2002,11(4):378-382

Yang X L,Zhan J,Huang Y P.Progress on research of toxic effect of organophosphorous pesticides on aquatic organism[J].Journal of Shanghai Fisheris University, 2002,11(4):378-382(in Chinese)

[2] Martin-Alguacil N,Babich H,Rosenberg D W,et al.In vitro response of the brown bullhead catfish cell line,BB, to aquatic pollutants[J].Archives of Environmental Contamination and Toxicology,1991,20(1):113-117

[3] Jobling S,Sumpter J P.Detergent components in sewage effluent are weakly oestrogenic to fish:An in vitro study using rainbow trout(Oncorhynchus mykiss)hepatocytes [J].Aquatic Toxicology,1993,27(3):361-372

[4] 郭华荣.海水鱼细胞系FG,SPH和RSBF的特性分析及其在典型海洋污染物毒性检测上的应用[D].北京:中国科学院,2001

Guo R H.Charaeterization of three marine fish cell lines FG,SPH and RSBF and their application toxicity assay of aquatic pollutants[D].Beijing:Chinese Academy of Sciences,2001(in Chinese)

[5] 殷立成,郭华荣.除草剂丁草胺对牙鲆及其鳃细胞系的急性毒性研究[D].青岛:中国海洋大学,2007

Yin L C,Guo H R.Studies on the acute toxicity of herbicide butachlor on flounder,Paralichihys olivaceusand its gill cell line(FG)[D].Qingdao:Ocean University of China,2007(in Chinese)

[6] 魏云波.褐点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus)三种细胞系的建立,病毒敏感性以及环境污染物对其毒性作用的研究[D].青岛:中国海洋大学,2009

Wei Y B.Establishment and viral susceptibility evaluation of three novel cell lines from brown-marbled grouper, Epinephelus fuscoguttatus,and their cytotoxicities treated by environmental pollutants[D].Qingdao:The Ocean U-niversity of China,2009(in Chinese)

[7] 樊廷俊,孙爱,杨秀霞,等.大黄鱼鳍细胞系的建立及久效磷对其毒性作用的研究[J].中国海洋大学学报:自然科学版,2010(12):64-70

Fan J T,Sun A,Yang X X,et al.Establishment and identification of a continuous fin cell line from large yellow croaker,Pseudosciaena croceaand cytotoxic effects of monocrotophos to the fin cells[J].Periodical of Ocean U-niversity of China:Natural Science,2010(12):64-70(in Chinese)

[8] 李羡筠,甘永金,郑艳艳.沙蚕毒农药杀虫单原药的致突变作用[J].应用预防医学,2007(6):365-367

Li X J,Gan Y J,Zheng Y Y.Mutagenic effects nereistoxin pesticides original drug monosultap[J].Applied Preventive Medicine,2007(6):365-367(in Chinese)

[9] Sandra P,Guillamon M,Barcelod D.Quantitative analysis ofPolycyclicaromatic hydrocarbonsin sewage sludge from wastewater treatment plants[J].Journal of Hromatography,2001,938(59):57-65

[10] 黄雅俊.杀虫单在土-水-稻中残留降解动态的研究[D].杭州:浙江大学,2003

Huang Y J.Study on residue and degradation of monosultap in soil-water-paddy system[D].Hangzhou:Zhejiang University,2003(in Chinese)

[11] 杨启超,万全,赵俊峰,等.4种常用鱼药对泥鳅的急性毒性实验[J].水利渔业,2006,26(2):93-95

Yang Q C,Wan Q,Zhao J F,et al.The acute toxicity tests of 4 kinds of commonly fish medicines on loach[J].Reservoir Fisheries,2006,26(2):93-95(in Chinese)

[12] Shao J,Shi G Q,Song M S,et al.Development and validation of an enzyme-linked immunosorbent assay for vitellogenin in Chinese loach(Misgurnus anguillicaudatus) [J].Environment International,2005,31(5):763-770

[13] 陈玉明,卢少勇,朱旭,等.泥鳅在污染物毒性评价中的应用研究[J].生态毒理学报,2013,8(4):447-455

Chen Y M,Lu S Y,Zhu X,et al.A review on application of loach to toxicity of pollutants[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2013,8(4):227-455(in Chinese)

[14] 周立红,陈学豪,秦德忠.四种重金属对泥鳅胚胎和仔鱼毒性的研究[J].厦门水产学院学报,1994,16(1):11-19

Zhou L H,Chen X H,Qin D Z.Study of four heavy metals on loach embryonic and larval toxicity[J].Xiamen Fisheries College,1994,16(1):11-19(in Chinese)

[15] 楼允东,吴萍.两种农药对泥鳅红细胞微核和核异常的诱导[J].上海水产大学学报,1994,3(3):104-110

Lou Y D,Wu P.Induction of micronuclei and nuclear anomalies in erythocytes of loach by two pesticides[J]. Journal of Shanghai Fisheries University,1994,3(3):104-110(in Chinese)

[16] 李超,伏圣博,刘华玲,等.细胞凋亡研究进展[J].世界科技研究与发展,2007(3):45-53

Li C,Fu S B,Liu H L,et al.Advances in the study of cell apoptosis[J].World Science and Technology Research and Development,2007(3):45-53(in Chinese)

[17] Carlson K,Jortner B S,Ehrich M.Organophosphorus compound-induced apoptosis in SH-SY5Y human neuroblastona cells[J].Toxicology and Applied Pharmacology, 2000,168(2):102-113

[18] Peikert T,Specks U,Farver C,et al.Melanoma antigen A4 is expressed in non-small cell lung cancers and promotes apoptosis[J].Cancer Research,2006,66(9):4693-4700

[19] 朱丽岩.几种环境内分泌干扰物对青岛近海常见海洋动物的毒性效应[D].青岛:中国海洋大学,2005

Zhu L Y.Toxicity of several endocrine disrupting chemicals(EDCs)on usual marine animals in the offing of Qingdao[D].Qingdao:The Ocean University of China, 2005(in Chinese)

[20] 闫建国,汝少国,邴欣,等.久效磷对黄鳝过氧化氢酶和Na+,K+-ATP酶活性的影响[J].环境科学研究,2006, 19(3):96-100

Yan J G,Ru S G,Bing C X,et al.Effects of monocrotophos on the CAT and Na+,K+-ATPase activities in tissues ofMonopterus albus[J].Environmental Science Research, 2006,19(3):96-100(in Chinese)

[21] Galgani F,Bocquene G.In vitro inhibition of acetylcholinesterase from four marine species by organophosphates and carbamates[J].Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology,1990,45(2):243-249

[22] 魏渲辉,汝少国,姜明,等.有机磷农药对鱼类的毒性效应及内分泌扰乱作用[J].海洋科学,2002,26(9):27-31

Wei X H,Ru S G,Jiang M,et al.Toxic and endocrine disrupting effects of organophosphorus pesticides on fish[J]. Marine Science,2002,26(9):27-31(in Chinese)

[23] 苑宇哲,徐仕霞,姚春生,等.应用蝌蚪快速检测环境变异的两种方法—微核试验和单细胞凝胶电泳[J].四川动物,2004(1):74-76

Yuan Y Z,Xu S X,Yao C S,et al.Review on monitoring environmental contamination using micronucleus test and single cell gel electrophoresis(comet)assay in tadpole[J]. Sichuan Journal of Zoology,2004(1):74-76(in Chinese)

[24] 惠长野,郭妍,高朝贤,等.DNA氧化损伤对人外周血淋巴细胞微核率的影响[J].国际检验医学杂志,2014, 14:1823-1824

Hui C Y,Guo Y,Gao C X,et al.Effect of DNA oxidative damage on micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes[J].International Journal of Laboratory Medicine,2014,14:1823-1824(in Chinese)◆

In Vitro Cytotoxicity Test of Monosultap Using Different Ploidy Loach Fin Cell Lines

Xiang Yang1,Li Xia1,2,*,Qin Yanjie1,Shan Lijuan1,Yang Yanjin1

1.Key Laboratory of Marine Bio-resource Restoration and Habitat Reparation in Liaoning Province,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China
2.Key Laboratory of Mariculture of Agriculture Ministry,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China

13 May 2015 accepted 22 October 2015

In this study,loach findiploid cell line(DIMF)and triploid cell line(TRMF)were used to assess toxicity of monosultap in vitro.The 24 h semi-lethal concentrations of DIMF and TRMF measured by thiazole blue(MTT) method were 119.73 mg·L-1and 146.26 mg·L-1,respectively.DIMF was more sensitive to monosultap than TRMF. After exposure to monosultap,the cellular morphology showed the phenomenon with elongation,vacuolization andexfoliation.When the monosultap concentration was 0-100 mg·L-1,the activities of superoxide dismuta(SOD)and glutathione S-transferase(GST)in two cell lines were increased with the increase of concentration,however,while the concentration was 100-200 mg·L-1,the activities of both enzymes gradually decreased.When the concentration was 0-200 mg·L-1,the activity of acethlcholine esterase(AChE)in two cell lines was negatively correlated with the concentration of monosultap.The activties of three enzymes in TRMF were higher than those in DIMF.Micronucleus test showed that 50 mg·L-1monosultap could cause the nucleus damage and form micronucleus.The rate of micronucleus increased with the increase of monosultap concentration.When monosultap concentration was 200 mg ·L-1,the maximum micronucleus rates of DIMF and TRMF were 3.3‰and 3.7‰,respectively,and no significant differences were observed between two cell lines(P＞0.05).The electron microscopic observations showed that DIMF and TRMF presented similar pathological changes,showing chromatin condensation,margination and cell nucleus decomposition.The numbers of mitochondria,ribosomes and endoplasmic reticulum reduced.Vacuoles and apoptotic bodies appeared in cells,which showed the characteristic of apoptosis.The present results showed that the cytotoxic mechanism of monosultap was inducing apoptosis by changing the intracellular enzyme activity.Differences between two ploidy cell lines were mainly related to the large cell volume,much intracellular substance,rapid cell division and vigorous growth of triploid.

monosultap;loach;fin;cell lines;diploid;triploid;enzyme activity;micronucleus rate;ultrastructure; apoptosis

2015-05-13 录用日期：2015-10-22

1673-5897（2016）3-308-08

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150513002

简介：李霞(1961—)，女，海洋生物学硕士，教授，主要研究方向为水产动物繁育学，水产动物发育学，细胞工程等，出版专著和教材4部，发表学术论文百余篇。

国家自然科学基金(31272650)

向阳(1991-)，男，硕士研究生，研究方向为生态毒理学，E-mail:aliaswork@163.com

*通讯作者（Corresponding author），E-mail:lx@dlou.edu.cn