青春期双酚A结构类似物暴露对小鼠行为的影响

高强，李昕，郝耀光，赵亦雯，周婧弘，尹希，史海水

1.河北医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室，石家庄050017

2.河北医科大学基础医学院，石家庄050017

3.河北医科大学第四医院功能科，石家庄050011

4.河北医科大学基础医学院生化与分子生物学教研室，石家庄050017

青春期双酚A结构类似物暴露对小鼠行为的影响

高强1，李昕2，郝耀光2，赵亦雯2，周婧弘2，尹希3,*，史海水4,#

1.河北医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室，石家庄050017

2.河北医科大学基础医学院，石家庄050017

3.河北医科大学第四医院功能科，石家庄050011

4.河北医科大学基础医学院生化与分子生物学教研室，石家庄050017

作为重要的环境内分泌干扰物，双酚A的神经发育毒性已经引起广泛关注，其结构类似物对健康影响相关研究少有报道。为探讨双酚A结构类似物长期暴露对个体抑郁行为的影响，选取60只小鼠随机分为5组，每组12只。小鼠分别灌胃给予0、5、50 mg·kg-1的双酚F或双酚S，连续给药4周。给药结束后，利用强迫游泳测试和悬尾测试评价小鼠抑郁样行为，同时监测小鼠体质量增加和自发活动情况。结果表明，与溶媒对照组比较，持续4周的双酚F和双酚S给药组小鼠的体质量变化和自发活动均无显著差异；5 mg·kg-1的双酚F或双酚S处理均不显著改变小鼠的抑郁行为，50 mg·kg-1双酚F显著增加小鼠悬尾和强迫游泳测试中的不动时间，50 mg·kg-1双酚S处理显著增加小鼠悬尾测试中的不动时间。研究结果提示高浓度双酚F和双酚S在青春期的暴露可导致成年后小鼠抑郁样行为异常，应当引起重视。

环境内分泌干扰物；双酚F；双酚S；小鼠；抑郁

高强,李昕,郝耀光,等.青春期双酚A结构类似物暴露对小鼠行为的影响[J].生态毒理学报，2016,11(3):140-144

Gao Q,Li X,Hao Y G,et al.Effects of exposure to analogues of bisphenol A on depressive-like behaviors in mice[J].Asian Journal of Ecotoxicology, 2016,11(3):140-144(in Chinese)

双酚A(bisphenol A,BPA)是一种典型的环境内分泌干扰物，它作为食品和饮料的碳酸聚酯包装材料、牙齿固封剂以及其他产品的添加剂被大量使用[1]。来自流行病学和动物实验研究发现，BPA可发挥类雌激素活性，不同发育阶段的BPA暴露能显著增加个体焦虑和抑郁等神经行为，并具有长效和隔代影响[2-4]。BPA暴露是多种疾病，如肿瘤、肥胖、生殖能力损伤、神经精神疾病等发生的高风险因素，BPA暴露的健康危害引起社会广泛关注[5-9]。鉴于此，包括加拿大、欧盟、法国等相关部门先后制定措施，禁止进口、售卖含有BPA成分的婴儿用品[10-11]。寻求安全可靠的BPA替代品成为众多制造商的当务之急，BPA结构类似物成为首选。

BPA结构类似物，包括双酚S(bisphenol S, BPS)、双酚F(bisphenol F,BPF)、4-枯基苯酚(4-cumylphenol,HPP)等在市场上均有销售，并越来越多地被应用于实际生活当中。如BPS，在食品、超市购物小票、甚至在人的尿液样品中均有可能检测到其存在[12-13]。与对BPA的健康风险评估研究相比，对包括BPS、BPF在内的BPA结构类似物的暴露风险评估鲜有报道。青春期是个体发育过程中的一个敏感时期，个体情绪变化受环境因素影响更加显著[14]。考虑到与BPA结构的相似性，以及广泛应用的可能性，本研究应用经典的强迫游泳和悬尾测试动物模型，旨在探讨青春期长期BPS和BPF暴露对小鼠抑郁行为的影响，为评价BPS和BPF对健康的影响提供实验依据。

1 材料与方法（Materials and methods）

1.1 材料

1.1.1 实验动物

清洁级28日龄雄性ICR小鼠60只，体重22～ 24 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。小鼠分笼饲养，饲养环境为昼夜12 h交替，室温18 ～22℃，湿度50%～60%，自由摄食摄水。小鼠给药剂量参考BPA研究相关文献[15-17]，适应饲养1周后，小鼠随机分为5组：溶媒对照组、BPF处理组(5、50 mg·kg-1)、BPS处理组(5、50 mg·kg-1)，每天上午8 ～10点灌胃给药(10 mL·kg-1)，连续灌胃28 d。

1.1.2 试剂

BPF、BPS和羧甲基纤维素钠均购自上海Sigma-Aldrich公司，BPF和BPS悬浮于0.5%羧甲基纤维素钠溶液，于给药前新鲜配置。

1.2 方法

1.2.1 动物处理

BPF和BPS处理采用灌胃给药方式，连续给予28 d，给药结束后24 h后开始进行行为学测试。

1.2.2 体质量增加变化

第1天灌胃给药前，对小鼠进行编号，记录每只小鼠基础体质量，灌胃给药结束后再次称重，分别计算小鼠体质量变化情况。

1.2.3 自发活动

于末次灌胃给药第2天，小鼠进行自发活动测试，自发活动装置(上海吉量生物科技有限公司)采用视频监测系统。小鼠放置于自发活动箱中央区域，测试10 min，记录后6 min小鼠在自发活动箱运动总路程(mm)。

1.2.4 悬尾测试

悬尾测试于自发活动测试结束2 h后进行，试验装置为自制，悬尾测试参考文献进行[18]，用白色胶布于小鼠尾尖1 cm处将其倒置固定于悬杆上，悬挂6 min，记录后4 min小鼠不动时间(s)。

1.2.5 强迫游泳测试

于末次灌胃给药第3天进行，实验装置为直径20 cm、高40 cm的玻璃缸，水温23～25℃，水深25cm；小鼠进行行为学检测[18]，游泳6 min，记录后4 min小鼠漂浮不动时间(s)。漂浮不动标准为小鼠浮在水面不用四肢和尾巴维持身体平衡的状态。

1.2.6 数据分析

所有数据均用统计软件SPSS 17.0进行处理，各组数据资料用均数+标准差表示。各组均数的比较进行单因素(药物处理)方差分析(one-way ANOVA)，用最小显著差法(LSD)做两两比较，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果（Results）

2.1 双酚F和双酚S处理对小鼠体质量变化的影响

One-way ANOVA分析，BPS和BPF暴露对小鼠体重变化没有显著影响[F(4,44)=0.678，P=0.611]。和对照组比较，5和50 mg·kg-1剂量BPF、BPS给药处理均不显著改变小鼠体质量(P>0.05，见图1)。

图1 双酚F和双酚S暴露对小鼠体重变化的影响

2.2 自发活动测试

One-way ANOVA分析，BPS和BPF暴露对小鼠自发活动没有显著影响[F(4,44)=0.612，P= 0.657]。和对照组比较，5和50 mg·kg-1剂量BPF、BPS处理小鼠在测试时间内活动总路程没有显著差异(P>0.05，见图2)。

2.3 悬尾测试

One-way ANOVA分析，BPS和BPF暴露对悬尾测试实验中小鼠不动时间存在显著影响[F(4,44) =4.764，P=0.003]。和对照组比较，5 mg·kg-1剂量BPS和BPF灌胃给药对小鼠不动时间没有显著影响(P>0.05)，50 mg·kg-1剂量的BPS和BPF灌胃给药显著增加了小鼠的不动时间(P<0.05，见图3)。

图2 双酚F和双酚S暴露对小鼠自发活动的影响

图3 双酚F和双酚S暴露对小鼠悬尾不动时间的影响

图4 双酚F和双酚S暴露对小鼠游泳不动时间的影响

2.4 强迫游泳测试

和对照组比较，5 mg·kg-1BPF或BPS给药对小鼠不动时间均无显著影响(P>0.05)；50 mg·kg-1BPF给药显著增加了小鼠不动时间(P<0.05，见图4)，尽管50 mg·kg-1剂量BPS灌胃给药增加小鼠不动时间，但差异不具有显著性(P=0.056)。

3 讨论（Discussion）

本研究运用急性应激小鼠模型，首次评价了青春期长期BPA结构类似物BPS和BPF暴露对个体抑郁行为的影响，结果发现，28 d BPS和BPF灌胃给药对小鼠抑郁行为均具有显著影响，表现为BPF给药处理显著增加强迫游泳和悬尾测试实验中小鼠不动时间，而BPS给药处理显著增加悬尾测试实验中小鼠的不动时间，尽管BPS增加强迫游泳测试中小鼠不动时间，但差异不具有显著性；BPS和BPF在研究剂量范围内对小鼠自发活动和体重变化均不存在显著影响。

BPA结构类似物(如BPS、BPF)已经成BPA替代物的首选，已有研究发现，在食品包装材料、超市购物小票，甚至部分人群尿样中检测到BPA结构类似物(如BPS)的存在，但对BPA结构类似物的长期暴露风险仍未系统展开。一项来源于斑马鱼的研究发现，胚胎期BPS低剂量暴露，能够显著增加斑马鱼下丘脑神经发生，增加其自发活动[19]，提示BPA结构类似物的暴露对个体的神经发育和神经行为具有潜在影响。本研究所选用的强迫游泳测试和悬尾测试是广泛认可的抑郁行为评价的动物模型，测试过程中动物的不动时间可以反映动物的抑郁行为[18]，研究发现，BPS和BPF的长期暴露能显著增加小鼠的抑郁行为。

BPA兼具类雌激素、抗雌激素和抗雄激素活性，其长期暴露干扰内源性性激素对个体神经发育和神经行为，也会影响个体内分泌系统的正常功能[20-21]。双酚A暴露对神经行为的影响与暴露个体种属、暴露时间和暴露剂量等有关，其对行为的影响也可能会因为个体不同生命阶段(围生期、青春期、成年期)、性别差异等产生不同的效应[22-23]。与其他发育阶段比较，青春期个体性腺逐渐成熟，青春期阶段个体对双酚A或其结构类似物暴露更加敏感，其神经行为的影响可能会更加显著。Rosenmai等[24-25]的体外研究发现：和BPA相比较，BPS具有较弱的雌激素和抗雄激素特征，发育期BPS暴露会引起激素失衡，BPS和BPF却表现出很强的羟孕酮活性，降低小鼠和人的睾酮分泌。BPS和BPF暴露能显著降低青春期小鼠前额叶皮层神经甾体发生关键酶5α-还原酶的活性，影响多巴胺、5-羟色胺相关基因表达[26]。本研究发现，青春期BPS和BPF长期暴露影响小鼠抑郁行为，但不显著改变小鼠的体重变化。BPS和BPF暴露对抑郁行为的调节作用可能与其对内源性性激素的干扰效应有关，具体机制仍待进一步研究。

综上，青春期BPA结构类似物BPF和BPS的长期暴露，可增加小鼠的抑郁行为，对小鼠体质量变化和自发活动没有显著影响。作为BPA的潜在替代物，BPA结构类似物的推广使用需要谨慎，其长期暴露对健康尤其是抑郁行为的影响值得深入关注，不同发育阶段、不同性别个体BPA结构类似物暴露对健康的影响及其作用机制有待明确。

致谢：感谢河北医科大学营养学教研室马玉霞教授和周美琪老师在实验实施和论文修改过程中给予的帮助。

（References）：

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Effects of Exposure to Analogues of Bisphenol A on Depressive-like Behaviors in Mice

Gao Qiang1,Li Xin2,Hao Yaoguang2,Zhao Yiwen2,Zhou Jinghong2,Yin Xi3,*,Shi Haishui4,#

1.Department of Nutrition and Food Hygiene,College of Public Health,Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017,China
2.College of Basic Medicine,Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017,China
3.Department of Functional Region of Diagnosis,Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050011,China
4.Department of Biochemistry and Molecular Biology,Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017,China

5 August 2015 accepted 1 November 2015

The adverse effects of bisphenol A(BPA)on neurodevelopment and behaviors have been well established.However,the effects of exposure to BPA analogues,bisphenol F(BPF)and bisphenol S(BPS),on depressive-like behaviors are poorly understood.In the present study,sixty mice were randomly divided into 5 groups and

by gavage 0,5 or 50 mg·kg-1of BPF or BPS for 28 continuous days.Depressive-like behaviors were tested after BPF or BPS treatment by tail suspension test(TST)and forced swimming test(FST)mice paradigms.The bodyweight increased and locomotor activities of mice were also assessed.The results showed that BPF and BPS administration had no significant effects on both bodyweight change and locomotor activities.BPF or BPS treatment at 5 mg·kg-1dose had no significant effect on depressive-like behaviors.BPF treatment at 50 mg·kg-1significantly increased the immobility time in both FST and TST.BPS treatment at 50 mg·kg-1significant increased immobility time in TST,but just had an increased trend in FST.These findings indicated that chronic exposure to high BPF and BPS could affect the depressive-like behaviors in adult mice and should be paid more attention in the future.

environmental endocrine disruptor;bisphenol F;bisphenol S;mouse;depression

2015-08-05 录用日期：2015-11-01

1673-5897（2016）3-140-05

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150805001

简介：尹希(1979-)，女，硕士，主治医师，主要研究方向为神经内分泌免疫调节，已发表学术论文20余篇。

共同通讯作者简介：史海水(1980-)，男，博士，副教授，硕士生导师，主要研究方向为神经药理学，已发表学术论文60余篇。

国家自然科学基金(81201038，31371140)；河北省大学生创新创业资助课题(201410089042)；河北省科技厅科研基金(15275517)；河北省卫生与计生委科研基金(20150182，qn2015015)

高强(1982-)，男，讲师，研究方向为食品营养与食品毒理学，E-mail:gaobuzhang@163.com

*通讯作者（Corresponding author），E-mail:yinxixi2002@163.com

#共同通讯作者（Co-corresponding author），E-mail:shihs@hebmu.edu.cn