广州河涌水体中食蚊鱼肝脏性激素相关基因的表达水平研究

张晓婵，温茹淑，方展强,*

1.华南师范大学生命科学学院，广东省高等学校生态与环境科学重点实验室，广州510631

2.嘉应学院生命科学学院，梅州514015

广州河涌水体中食蚊鱼肝脏性激素相关基因的表达水平研究

张晓婵1，温茹淑2，方展强1,*

1.华南师范大学生命科学学院，广东省高等学校生态与环境科学重点实验室，广州510631

2.嘉应学院生命科学学院，梅州514015

应用食蚊鱼细胞色素P450芳香化酶基因(CYP19α)、卵黄蛋白原基因(VTGα)和雌/雄激素受体基因(ERα/ARα)mRNA转录水平为指标，评价广州海珠涌和黄埔涌食蚊鱼受环境激素物质干扰产生雌/雄性化效应的现状。结果显示，海珠涌宝岗大道段(BG)、洪德路段(HD)和黄埔涌赤岗路段(CG)、苗艺路段(MY)采样点雌鱼性腺CYP19α mRNA表达水平显著降低。雌鱼肝脏VTGα mRNA的表达水平在夏冬两季CG点都显著升高，但在BG、HD和MY点的表达水平在冬季则显著下降；夏冬两季雌鱼雄激素受体ARα mRNA表达水平在各点都显著升高。雄鱼性腺CYP19α mRNA表达水平在各点都无明显差异，但CG点在夏季显著升高，而MY点在冬季则显著下降；雄鱼肝脏VTGα和雌激素受体ERα mRNA表达水平分别在各点都显著升高，但夏季MY点和冬季HD、MY各点无明显差异。结果表明，雌性食蚊鱼的VTGα和CYP19α基因受到不同程度的抑制，ERα较对照REF明显升高，表现出雄激素效应；雄性食蚊鱼VTGα和ERα转录水平较对照REF显著升高，CYP19α基因无显著性差异，表现出雌激素效应。生活在广州海珠涌和黄埔涌中的食蚊鱼受雌/雄激素物质干扰明显，表明河涌中环境激素污染严重。

环境激素；食蚊鱼；广州河涌；目标基因；mRNA表达；生物化学

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国内外对城市污水中存在的环境内分泌干扰物(endocrine disrupting chemicals,EDCs)所展开的监测与毒性评价是目前环境科学研究的热点之一，尤其针对环境激素污染的监测及对生物体的危害效应评价已经做了不少工作，如开发斑马鱼(Danio rerio)、稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)、唐鱼(Tanichthys albonubes)、剑尾鱼(Xiphophorus helleri)等小型淡水鱼类作为模式动物开展相关方面的研究，但多数研究主要以采集生活污水进行室内暴露为主，究其原因主要是这些鱼类都不能在城市周边受污染的溪流或河涌中存活，而不能直接投放到野外受污染的水域中进行生物监测的研究[1-4]。食蚊鱼(Gambusia affinis)是一种原产北美洲的热带性卵胎生小鱼[5]，其入侵性非常强，因体形小、食性杂、繁殖周期短、产仔量大，已广泛分布于国内各地水域，尤其受污染的城市河涌中也可以生存。因此，直接观察野外河涌中生活的食蚊鱼，研究其受城市污水暴露后的生长发育、骨骼形态学及器官组织病理学变化，开发其在器官、组织、细胞及基因各级水平作为生物标志物监测城市水环境中可能存在的环境激素类物质污染的研究具有重要的学术意义和实际应用价值。

广州河涌的成分复杂，有机及无机组分种类繁多，导致水体中具有雌激素及雄激素活性的污染物浓度及组分千差万别。这使得以食蚊鱼为模式生物，对实际水体所受到的污染开展相关生态安全评价具有重要的现实意义。本实验选用分子生物学标志物监测广州市海珠涌和黄埔涌中存在的EDCs致食蚊鱼的生物学效应。用雌鱼性腺CYP19α、肝脏VTGα和臀鳍ARα基因表达水平的变化检测雄性化效应；用雄鱼性腺CYP19α、肝脏VTGα和臀鳍ERα基因表达水平的变化检测雌性化效应。本研究以食蚊鱼为指标对广州市部分河涌的污染状况进行较全面地监测与评价，其结果能为环保有关部门提供有参考价值的数据，有利于科学的保护和开发利用城市河涌的水环境系统，并且将有助于发展将食蚊鱼作为内分泌干扰效应研究的模式实验动物。

1 材料与方法（Materials and methods）

1.1 采样点

根据食蚊鱼生长的情况和捕鱼的便利性，本研究选取了对照点(REF)、宝岗大道段(BG)、洪德路段(HD)、赤岗路段(CG)、苗艺路段(MY)等5个采样点，BG、HD分别位于广州市海珠涌中下游的路段；CG、MY分别位于黄埔涌中下游的路段。REF为不受城市废水污染的地点，设在华师内的中心湖。在对照点采集的食蚊鱼先在实验室驯养2周后进行实验，驯养鱼用水为曝气除氯后的自来水。采集食蚊鱼的同时，使用GPS测定采样点的位置，并使用水质监测仪(YSI556MPS)测定各采样点的水质参数，如pH值、温度、电导性和溶解氧。

1.2 实验动物

食蚊鱼采集分别于2013年6月(夏季)和2012年12月(冬季)进行，在不同的采样点用大型鱼网随机捕捞，并保证每个采样点食蚊鱼的总尾数在200以上。采集的食蚊鱼放入编号的大型塑料桶中，每个塑料桶盛装10 L原采样点的河涌水，并在桶中放入适量的水草，以减少食蚊鱼在运输过程中造成的损伤。食蚊鱼于当日运回实验室并进行各组实验。

正常的雌、雄个体鉴别及其性成熟的鉴定参照Leusch等[6]的方法：A.未成年雄性，臀鳍的第3鳍条长度延长，基部宽度加宽，但生殖足未发育完全；B.成年雄性，鳍条生殖足端部出现钩和肘；C.未成年雌性，体长＜20 mm，第3鳍条长度未延长，基部宽度未加宽；D.成年雌性，体长≥20 mm，第3鳍条长度未延长，基部宽度未加宽；E.怀孕雌鱼，腹部下端出现黑色孕斑。但由于本研究中雌性食蚊鱼受到城市废水的影响出现一定的雄性化现象，第3臀鳍条有所延长，故为了避免雄性化作用对性别区别造成干扰，因此本文参考正常的雌雄鉴别方法外，同时把第3臀鳍条长度延长且交接器具有钩状结构的食蚊鱼定义为成熟的雄性食蚊鱼，第3臀鳍条长度延长但不带钩状结构的且体长≥20 mm定义为雄性化的雌性食蚊鱼。

实验鱼用大型水族网捕捞后放入装有采样点水样的塑料桶中运回实验室后，分别筛选成年雄性食蚊鱼(B，体全长18.88～23.74 mm；体重54.12～98.77 mg)和成年雌性食蚊鱼(D，体全长21.43～25.20 mm；体重99.12～442.78 mg)，设定各个试验组，并在当天解剖提取食蚊鱼的目标器官(肝脏、性腺、臀鳍)50～100 mg装入有标签的离心管，迅速放入液氮中速冻后统一转入-80℃超低温冰箱中暂存，直至RNA提取试验。

1.3 试剂与仪器

超低温冰箱(Revco,美国)，Nanodro-1000型分光光度计(Thermo Fisher Scientific,美国)，PCR仪(Bio-rad,美国)，超净台(苏州安泰)，BG-Power600型电泳仪(北京)，烘烤箱(上海森信)，灭菌锅(苏州安泰)，DK-8D型电热恒温水槽(上海森信)。

RNAisoPlus(TAKARA，Dalian，China)， FastQuant RT Kit(With gDNase)(TIANGEN,China)，SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(TIANGRN, China)。其他生化试剂盒化合物均为符合实验要求的国产试剂。

1.4 实验方法

登录NCBI网站，找到西部食蚊鱼(Gambusia affinis)的VTGα、ERα、ARα、CYP19α cDNA的序列，利用Primer 3软件(http://frodo.-wit.Edu/)，由生物工程(上海)公司合成需要的引物。本研究相关基因扩增引物名称及其序列见表1。

总RNA提取：分别将肝脏和性腺组织匀浆，臀鳍条则研磨成粉末，分别加入1 mL的Isoplus RNA (RNAiso Plus)提取液(TakaRa)进行总RNA提取。RNA提取后进行基因组DNA的去除，并检测RNA浓度及其完整性，保证A260/A280的比值在1.8～2.0 (TakaRa)。

使用TakaRa Code：DRR037 PrimScriptTMRT reagents Kit(Perfect Real Tome)产品。RT反应液配制如下：5×PrimeScript Buffer(2 μL)，PrimeScript PT Enzyme Mix I(0.5 μL)，Random 6 mers(100 μmol· L-1,0.5 μL)，Oligo dT Primer(50 μmol·L-1,0.5 μL), Total RNA(1 μL)，Rnase Free dH2O(5.5 μL)，总共10 μL。反转录反应条件如下：37℃15 min(cDNA合成)，85℃5 s(酶失活)。

表1 相关基因扩增引物名称及其序列Table 1 Name and sequence of the target gene amplified with primers

使用TakaRa Code：DRR081A SYBR®Premix ExTaqTMII(2×)10.0 μL，正反向引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL，ROX References Dye(50×)or ROX References Dye(50×)0.4 μL,cDNA模板2.0 μL，H2O (灭菌)6.0 μL，总共20.0 μL。按照两步法PCR扩增标准程序进行RT-PCR反应。两步法PCR扩增标准程序：95℃预变性15 min；95℃变性10 s、60℃退火32 s共40个循环。

RT-PCR扩增结果数据的处理采用相对定量法，内参基因选用β-actin。经荧光定量PCR分析仪分析，得出精确的Ct值后，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。

校正值=目的基因定量结果/管家基因定量结果

相对值=待测样品的校正值/对照样品的校正值

即倍数(Folds)=2-△△Ct=2-((Ct A-Ct A actin)-(Ct B-Ct B actin))

式中，A为对照点的样品；B为广州河涌各采样点样品；Ct值为阈值循环数。

1.5 数据统计与处理

使用SPSS 19.0统计软件对所得数据进行统计学分析，采用单因素方差分析(One wey-ANOVA)法对数据进行差异性分析。用Excel 2013做柱形图。设置P<0.05时，表示差异显著；当P<0.01时，表示差异极其显著。

2 结果（Results）

2.1 各采样点的水质参数

对各采样点水质的监测结果显示，夏季及冬季各采样点的pH均处于正常范围(6～9)内，变化不大。各采样点冬季水温在17～21℃之间；夏季在28～29℃之间。对照点的溶解氧为(9.76±0.13)mg· L-1(夏季)、(10.91±0.15)mg·L-1(冬季)，鱼类正常生长所需溶解氧为5 mg·L-1及以上，可见对照点中氧气充足，适于食蚊鱼正常生长。而采样点中只有苗艺采样点(冬季)的溶解氧高于5 mg·L-1，其余采样点溶解氧处于1～3 mg·L-1波动，食蚊鱼供氧不足。对照点的电导率最低，分别为(204±3.77)μs·cm-1(夏季)、(234±2.17)μs·cm-1(冬季)，金属离子和酸根离子的含量则相对比较低，水质较为纯净。而采样点中苗艺采样点电导率较高，(549±3.83)μs·cm-1(夏季)、(447±2.73)μs·cm-1(冬季)，金属离子和酸根离子的含量相对较高，水体的导电率较大。其余采样点的电导率在300～400 μs·cm-1左右波动。

2.2 雌性食蚊鱼雄激素效应相关基因表达水平的变化

图1 不同采样点和不同季节雌性食蚊鱼雄激素效应相关基因表达水平的比较

夏季生活在受城市废水污染的广州河涌中的雌性食蚊鱼性腺CYP19α、肝脏VTGα和臀鳍ARα基因mRNA的表达水平如图1A所示。与对照点相比，海珠涌和黄埔涌的所有采样点的成年雌性食蚊鱼的性腺CYP19α mRNA的表达水平显著降低(宝岗大道段：0.084倍，P<0.01；洪德路段：0.136倍，P <0.01；赤岗路段：0.598倍，P<0.05；苗艺路段：0.258倍，P<0.01)。而肝脏VTGα mRNA的表达水平除了赤岗路段点(赤岗路段：1.61倍，P<0.05)升高外，其余各点变化不明显。但不同采样点变化趋势不一致，在宝岗大道段、洪德路段点呈下降趋势，而在赤岗路段、苗艺路段点呈上升趋势。与对照点相比，雄激素受体ARα mRNA表达水平显著升高(宝岗大道段：5.34倍，P<0.01；洪德路段：4.22倍，P <0.01；赤岗路段：1.52倍，P<0.05)，其中在宝岗大道段、洪德路段点显著上升(P<0.01)，在苗艺路段点无明显差异。

冬季生活在广州城市废水中雌性食蚊鱼性腺CYP19α、肝脏VTGα和臀鳍ARα mRNA的基因表达水平如图1B所示。与对照点相比，广州海珠涌和黄埔涌的除赤岗路段点外，其余各点的成年雌性食蚊鱼性腺CYP19α mRNA表达水平显著降低(宝岗大道段：0.285倍，P<0.01；洪德路段：0.112倍，P<0.01；苗艺路段：0.422倍，P<0.01)。而肝脏VTGα mRNA的表达有2种变化趋势，其中在宝岗大道段、洪德路段、苗艺路段点呈下降趋势(BG：0.273倍，P<0.01；洪德路段：0.260倍，P<0.01；苗艺路段：0.64倍，P>0.05)，在赤岗路段点呈上升趋势(赤岗路段：1.95倍，P<0.01)。与对照点相比，雄激素受体ARα mRNA表达水平除了赤岗路段点外，其余各点有明显升高的趋势(宝岗大道段：1.60倍，P <0.01；洪德路段：2.06倍，P<0.01；苗艺路段：4.57倍，P<0.05)，其中在苗艺路段点差异最显著(P<0.01)。

结果显示，夏、冬季生活在受废水污染的河涌中雌性食蚊鱼的VTGα和CYP19α基因受到不同程度的抑制，ERα较之REF明显升高，雌性食蚊鱼表现出雄激素效应。

2.3 雄性食蚊鱼雌激素效应相关基因表达水平的变化

夏季生活在广州城市废水中的雄性食蚊鱼性腺CYP19α、肝脏VTGα和臀鳍ERα mRNA的表达水平如图2A所示。与对照点相比，除了赤岗路段点有上升的趋势(赤岗路段：6.04倍，P<0.05)外，广州海珠涌和黄埔涌中的成年雄性食蚊鱼性腺CYP19α mRNA基因表达水平没有明显变化。而肝脏VTGα mRNA表达水平都显著升高(宝岗大道段：6.04倍，P<0.01；洪德路段：5.68倍，P<0.01；赤岗路段：26.65倍，P<0.01；苗艺路段：8.27倍，P< 0.01)，其中在赤岗路段点变化最明显。而雌激素受体ERα mRNA表达水平除了苗艺路段点外，其余各点有升高的趋势(宝岗大道段：1.98倍，P<0.05；洪德路段：4.64倍，P<0.01；赤岗路段：1.76倍，P<0.05)，但升高幅度不大，其中在洪德路段点变化最明显。

图2 不同采样点和不同季节雄性食蚊鱼雌激素效应相关基因表达水平的比较

冬季生活在广州城市废水中雄性食蚊鱼性腺CYP19α、肝脏VTGα和臀鳍ERα mRNA的表达水平如图2B所示。与对照点相比，广州海珠涌和黄埔涌中的成年雄性食蚊鱼的性腺CYP19α mRNA表达水平都没有明显变化，苗艺路段点则有下调趋势(苗艺路段：0.494倍，P<0.05)。而肝脏VTG α mRNA表达水平显著升高(宝岗大道段：5.68倍，P <0.01；洪德路段：2.54倍，P<0.01；赤岗路段：20.34倍，P<0.01；苗艺路段：6.74倍，P<0.01)，其中在赤岗路段点变化最明显，其余各点都在10倍以下。而雌激素受体ERα mRNA的表达水平在宝岗大道段、赤岗路段点有明显升高的趋势(宝岗大道段：1.68倍，P<0.05；赤岗路段：1.51倍，P<0.05)，其余各点无明显变化。

结果显示，夏、冬季生活在受废水污染的河涌中雄性食蚊鱼VTGα和ERα转录水平较REF显著升高，CYP19α基因则无显著性差异，雄性食蚊鱼表现出雌激素效应。

3 讨论（Discussion）

3.1 广州河涌城市废水暴露致雌性食蚊鱼雄激素效应

在生物体中，芳香化酶可以催化雄激素转化成雌激素，促进肝脏合成卵黄蛋白原，从而保证卵子的发育可以正常进行。而本研究中雌鱼CYP19α表达水平显著降低，推测体内雌激素合成通路受阻，雄激素水平则上升，性腺转向雄性方向发育，从而出现雄性化征状。不少研究表明CYP19α表达下调是雌性退化的反馈性调节结果，是雌性性腺退化的分子标记之一。Kitano等[7]认为睾酮(MT)诱导日本鲽的机制同芳香化酶抑制剂一样，抑制日本鲽性腺芳香化酶的表达，导致雌二醇(E2)总量降低，从而诱导雌鱼转变为雄鱼。杨隽等[8]研究发现，壬基酚(NP)诱导比目鱼幼鱼雌性化的同时伴随着CYP19α表达的上调，而用芳香化酶抑制剂法倔唑(fadrozole)喂食以及用MT染毒都能诱导遗传学雌性比目鱼性别转换为雄性，同时检测到对CYP19α表达的抑制。李广丽等[9]发现埋植MT后性腺芳香化酶活性和血清中E2浓度变化不显著，但CYP19α表达却显著降低，并诱导赤点石斑鱼发生性逆转。舒琥等[10]给2龄雌性赤点石斑鱼3次埋植雄烯二酮(AED)后引起了性别逆转，并发现发生性别逆转的个体性腺CYP19表达水平和活性显著降低。汪奇[11]研究表明芳香化酶抑制剂来曲唑(LE)可导致基因型雌鱼发生雄性化逆转，形成有功能的精巢；该阶段CYP19α表达下调和DMRT1表达上调是雄性化逆转的标志。本研究与上述研究结果相一致，食蚊鱼雌鱼CYP19α表达水平显著降低，从而导致内源激素平衡被改变。推测广州河涌中城市废水存在某些化合物抑制卵巢中CYP19α的表达，从而诱导雌鱼雄性化。本研究发现，除了赤岗路段点外，其他采样点雌鱼VTGα mRNA的表达水平都呈下降趋势。有研究表明，雌鱼暴露在雄激素中会导致VTGα mRNA的表达水平下降[12]。这与作者发现的宝岗大道段、洪德路段采样点中雌鱼的形态出现了第4臀鳍条长度延长、第3臀鳍条分节数增多，第14、15、16椎体脉棘向前弯曲等雄性化现象是一致的[13]。因此推测雌鱼VTGα的表达水平下降表明广州河涌城市废水中可能存在类雄激素相关的化合物，抑制了食蚊鱼VTG α的表达，从而出现不同程度的雄激素效应。而赤岗路段点雌鱼VTGα的表达水平呈上升趋势，一方面可能因为此采样点的雌鱼处于卵黄生成期，在此期间生成大量卵黄蛋白原；另一方面也可能因为黄埔涌中雌激素/类雌激素效应较强，导致VTGα表达上升，致使性腺发育提前。具体原因仍需作进一步探究。但结合作者同期的研究发现海珠涌及黄埔涌的雌鱼出现雄性化征状，可以推断广州城市废水中存在雄激素或类雄激素化合物，促使雌鱼雄性化[13]。

食蚊鱼具有两个由不同基因编码的雄激素受体，称之为ARα和ARβ。Sone等[14]研究表明臀鳍中ARα mRNA的转录水平与雄激素物质的含量之间具有较好的剂量效应曲线，雄鱼受到雄性激素的作用之后，臀鳍中AR的表达增加，促使臀鳍变成了生殖足。Ogino[15]认为雌鱼臀鳍的延长依赖于臀鳍上基因的表达，自然条件下这些基因受鱼体内源激素的调控，但也可以受到外界激素的影响，水体中的雄激素物质可以直接结合臀鳍上的受体发挥作用。Larsson等[16]研究认为，造纸废水中含有大量性腺雄激素受体的配体，能激活雄激素受体，引起鱼类的雄性化。因此，ARα mRNA的表达水平可以作为生物标记物监测水体雄激素污染。本研究结果表明，与对照点相比，雌鱼ARα的表达水平有升高的趋势，其中海珠涌的采样点宝岗大道段、洪德路段显著升高，而黄埔涌的采样点有升高趋势但差别不明显。结合实地观察分析，海珠涌附近有大量工业区、居民区，日排污量大，水质乌黑甚至发出恶臭，污染程度严重；而黄埔涌的河涌宽大，水质较为清澈，除了食蚊鱼外还能见到大量其他品种如鲫鱼、罗非鱼、鲤鱼，污染程度较低。另外在同期的研究中，作者也发现海珠涌的宝岗大道段、洪德路段点及黄埔涌苗艺路段点中雌鱼的形态出现了第4臀鳍条长度延长、第14、15、16椎体脉棘向前弯曲等雄性化现象，但黄埔涌赤岗路段点无明显差异[13]。实际上水环境中的雄激素含量并不高，但生活在其中的鱼是世代暴露的，在长期的不断暴露下，低剂量的雄激素经过时间累积可以对食蚊鱼产生了影响。初步推测海珠涌存在某些化合物具有雄激素配体的结构，直接与食蚊鱼臀鳍的AR进行结合，诱导其发生表达，从而引起了雌鱼臀鳍的延长、分节数增多。而黄埔涌上游赤岗路段及下游苗艺路段具有差异性，则可能因为水环境中除了存在雄激素物质外，还存在其他大量的抗雄激素物质(雄激素受体抑制剂)及雌激素。化学物成分复杂，具体差别仍需要进一步检测黄埔涌中内分泌干扰物的含量[13]。

本研究结果发现，生活在受废水污染的河涌中雌性食蚊鱼的VTGα和CYP19α基因受到不同程度的抑制，ARα较之对照点明显升高。根据目标基因表达的结果同时结合作者同期的研究发现，海珠涌及黄埔涌的雌鱼出现形态雄性化征状，推测广州城市废水中存在雄激素或类雄激素化合物，致使雌性食蚊鱼表现雄激素效应。

3.2 广州河涌城市废水暴露致雄性食蚊鱼雌激素效应

本研究中，广州海珠涌和黄埔涌中除苗艺路段点外，其余各点的成年雄性食蚊鱼性腺中的CYP19α表达水平没有明显的变化。Carreau等[17]对10多种鱼类芳香化酶的分布进行比较总结，发现P450aromA主要在这些鱼的卵巢中表达，在睾丸和脑中仅微量存在。同时Tong[18]也发现CYP19α主要在卵巢表达，雄鱼在精巢间质细胞中仅有少量表达，合成的雌激素参与维持精原细胞增殖。故因其微量存在表达水平没有明显变化。芳香化酶的调节机制较为复杂，目前的研究结果不相一致，还没有形成统一的认识。本研究中雄性食蚊鱼性腺中的CYP19α表达水平没有出现明显变化的原因则还有待作进一步研究。

目前已经有许多研究采用不同鱼种的卵黄蛋白原(VTG)作为生物标志物对环境雌激素效应进行检测。Orlando等[19]发现造纸废水中存在的雄激素物质在水环境中很容易被转化为雌激素物质，从而引起了鱼类产生雌激素效应，诱发雄鱼VTG基因的表达。Matthiessen等[20]对污染较重的河流中鲶鱼的调查发现，89%以上的雄鱼出现卵黄蛋白原基因表达，近17%的雄鱼出现雌雄同体现象。加拿大学者对11家造纸厂排放的废水进行研究，发现雄性黑头呆鱼暴露于20%和40%浓度后，其VTG的表达显著升高[21]。近年探索应用食蚊鱼的卵黄蛋白原(VTG α)基因转录水平为指标，评价广东东莞寒溪河受雌/雄激素物质污染现状的研究已有报道，其研究结果显示，生活在东莞寒溪河中的雄性食蚊鱼受雌激素物质干扰明显，普遍出现显著的雌激素效应，表明寒溪河水体受雌激素物质污染更严重[22]；同时进行了室内模拟实验，研究了该地(樟村)污水处理厂出水原液不同浓度暴露对食蚊鱼的形态雌性化生物学效应。结果显示，雄鱼肝脏VTGα mRNA转录水平显著升高，并且其升高趋势与暴露浓度相一致，表明雄性食蚊鱼雌性化明显，这表明，东莞城市废水中存在能致食蚊鱼发生雌激素效应的内分泌干扰物质[23]；该作者进一步对东莞寒溪河水体雌激素物质含量进行了检测，结果证实，东莞寒溪河水域中雌激素类物质雌酮(E1)和双酚A(BPA)分别为1.34～18.32 ng· L-1和33.84～45 766.41 ng·L-1，因此推测废水中E1和BPA在引起当地水域食蚊鱼雌激素效应中起到重要作用[24]。本研究结果与上述的研究相一致，广州海珠涌和黄埔涌夏季和冬季所有采样点的雄鱼VTGα表达水平显著升高，其中黄埔涌比海珠涌变化更为显著，有的采样点高达20多倍。因此推测广州河涌城市废水中可能存在类雌激素相关的化合物，诱导VTGα mRNA的表达，从而出现不同程度的雌激素效应。但是本文作者的同期研究结果发现，尽管生活在广州海珠涌和黄埔涌中4个采样点成年雄性食蚊鱼第4臀鳍条的长度值显著小于对照点，但是所有采样点的成年雄性食蚊鱼第4：6臀鳍条长度比值则无明显差异。此外，各采样点成年雄性食蚊鱼第14、15、16椎体脉棘的P值、P:D和P:L比值没有明显变化[13]。这些结果表明，分子效应与形态变化的效应存在差异，食蚊鱼VTGα mRNA的表达量虽然提高而表现雄性食蚊鱼产生雌激素效应，但效应的强弱将可能决定雄性食蚊鱼骨骼形态雌性化的效果。

雌激素的生物学效应主要通过其特异性受体雌激素受体的介导实现。不少研究发现暴露城市废水的雄性食蚊鱼ERα表达水平升高，引起雄鱼雌性化效应[25]。同时雌激素基因受体、芳香化酶基因敲除后的雄性小鼠会出现不育[26]。本研究中，雄鱼ERα表达水平在宝岗大道段、赤岗路段点有明显升高的趋势(P<0.05)，其余各点无明显变化。可见海珠涌和黄埔涌中的食蚊鱼存在雌激素效应，但效应强弱在不同各采样点具有差异。其中无论夏季还是冬季，赤岗路段点雄鱼ERα的表达水平显著上升(P< 0.05)，同时VTGα的表达中，赤岗路段点高达20多倍，故可以初步推测黄埔涌的赤岗路段段存在显著的雌激素效应。

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Transcription Levels of Sex Hormone Genes in Liver of Mosquitofish in the Creek of Guangzhou City

Zhang Xiaochan1,Wen Rushu2,Fang Zhanqiang1,*

1.Key Laboratory of Ecology and Environmental Science in Guangdong Higher Education,College of Life Science,South China Normal University,Guangzhou 510631,China
2.College of Life Science,Jiaying University,Meizhou 514015,China

31 July 2015 accepted 8 October 2015

The cytochrome P450 aromatase(CYP19α),vitellogenin(VTGα)and estrogen/androgen receptor(ER α/ARα)genes mRNA transcriptional levels in mosquitofish(Gambusia affinis)were detected in order to monitor the pollution status of environmental estrogen/androgen substances in the creek of Haizhu and Huangpu,Guang-zhou city.The results showed that,theCYP19α mRNA transcription levels in gonad of female mosquitofish from sampling sites of Haizhu Baogang Avenue(BG),Hongde Road(HD)and Huangpu Chigang Road(CG),Miaoyi Road(MY)significantly decreased(P<0.05 orP<0.01)when compared with the control point of Huashi(REF); theVTGα mRNA transcription levels in liver of male mosquitofish from sampling sites of BG,HD and MY significantly decreased(P<0.05 orP<0.01)except CG when compared with the control point of REF;theARα mRNA transcription levels in anal fin of female mosquitofish from all sampling sites significantly increased(P< 0.05 orP<0.001)in summer and winter.Except CG in summer and MY in winter theCYP19α mRNA transcription levels in gonad of male mosquitofish were not significantly different in other sampling sites;theVTGα mRNA andERα mRNA transcription levels in male mosquitofish from all sampling sites significantly increased(P< 0.05 orP<0.001)except HD and MY when compared with the control point of REF.The results indicated that, VTGα genes in liver andCYP19α genes in gonad of female mosquitofish were subject to different degrees of inhibition,andARα mRNA transcription level was significantly higher than that in the REF,showing the effects of androgens.TheVTGα mRNA andERα mRNA transcription level in male mosquitofish were significantly higher than that in the REF,andCYP19α gene expression in male mosquitofish was not significantly different,showing the effects of estrogens.Mosquitofish in the creek of Haizhu and Huangpu were significantly influenced by estrogen/androgen material interference,and the environmental hormone pollution in the creek of Guangzhou city was very serious.

environmental hormones;Gambusia affinis;the creek of Guangzhou city;target gene;mRNA expression;biochemistry

2015-07-31 录用日期：2015-10-08

1673-5897（2016）3-115-09

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150731002

简介：方展强(1953—)，男，教授，博士生导师，主要研究方向为水生动物生态毒理学，发表学术论文170余篇。

广东省科技计划项目(2012B030800006)；广东高校城市水环境生态治理与修复工程技术研究中心建设项目(2012gezxA004)

张晓婵(1988-)，女，硕士研究生，研究方向为水生动物生态毒理学，E-mail:390267054@qq.com

*通讯作者（Corresponding author），E-mail:fangzhq@scnu.edu.cn