张瑛,王斯扬,张锡龙,王东洲,周斯芸,周集体
大连理工大学化工与环境生命学部环境学院,工业生态与环境工程教育部重点实验室,大连116024
不同微藻对典型行业废水急性毒性响应的敏感性研究
张瑛*,王斯扬,张锡龙,王东洲,周斯芸,周集体
大连理工大学化工与环境生命学部环境学院,工业生态与环境工程教育部重点实验室,大连116024
研究考察了不同行业废水对4种微藻24 h和72 h的急性毒性效应。以斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、海水小球藻(Chlorellaspp.)以及等鞭金藻(Isochrysis galbana)为指示生物,采用COD浓度较高的焦化厂实际生产废水和制药厂实际生产废水、COD浓度较低的印染厂生化处理后出水和城市污水处理厂进出水作为受试水体,以微藻的生长抑制率为测试指标,评价微藻对不同行业废水的急性毒性效应和敏感性。结果表明,不同行业废水对4种微藻的急性毒性效应有所不同:焦化废水对等鞭金藻的生长抑制作用最强,制药废水对斜生栅藻的毒性效应最为明显,印染废水及城市污水处理厂的进出水对海水小球藻的毒性较为显著,说明不同微藻对不同行业废水毒性的敏感性存在差异。上述研究结果为废水毒性评价中受试物种的选择提供了基础数据。
焦化废水;印染废水;制药废水;城市废水;微藻;生物毒性评价
张瑛,王斯扬,张锡龙,等.不同微藻对典型行业废水急性毒性响应的敏感性研究[J].生态毒理学报,2016,11(3):92-100
Zhang Y,Wang S Y,Zhang X L,et al.Comparative study on acute toxic effect response of four microalgae to typical industrial wastewaters[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(3):92-100(in Chinese)
我国排放到河流和海洋中的废水,其中有毒有害污染物并没有得到完全的去除,可能对受纳水体中的生物产生毒害作用,造成水质恶化、富营养化等现象,带来潜在的水生态风险,并有可能通过食物链进一步对人类健康产生危害[1-8]。工业废水组分复杂、有毒有害物质浓度高,因此,其排放对受纳水体的生态环境带来的潜在风险则更为受到人们的关注。由于我国特殊的产业结构,焦化废水、印染废水等已经成为具有中国特色的典型行业废水。
目前我国废水的排放标准中主要的控制指标为化学需氧量(chemical oxygen demand,COD)、氨氮等理化指标,缺乏表征废水毒性的相关指标。有研究表明,即使工业废水的出水COD等化学指标达到污水排放标准,仍然显示出生物毒性效应[9-10]。为控制水体的毒性及其相关的生态风险,有必要对废水的毒性进行监测和表征。
关于废水毒性的测试方法,国内外已有应用生物毒性测试评价废水生态风险性的相关方案[11],如美国环保局于2002年提出的全废水毒性测试(whole effluent toxicity,WET)[12]法。废水急性毒性实验中,多采用发光细菌(费希尔弧菌)、藻类、水蚤类和鱼类等作为指示生物。藻类由于其个体小、繁殖世代时间短[13]、对环境影响相对敏感,被国内外很多研究者用于毒性实验研究[14-15],有研究表明它对某些毒性污染物的敏感性要优于无脊椎动物和鱼类[11,16]。
以微藻类作为指示生物的毒性实验,目前的研究多集中在考察化学品及环境样品中的毒性效应及其相对敏感性等方面[14-15,17-23]。因此,在评价废水的综合毒性时,如果选用藻类作为受试生物,必须考虑受试藻类对污水的敏感性。但是,目前关于废水对不同微藻的毒性效应及藻类相对敏感性的研究还鲜有报道。
为了解不同行业废水可能带来的生态风险,本研究考察了不同行业废水对微藻的急性毒性效应:受试藻类选用国内外研究者常用的[20-23]、在我国河流及近海海岸常见的淡水微藻(斜生栅藻Scenedesmus obliquus、蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa)和海洋微藻(等鞭金藻Isochrysis galbana、海水小球藻Chlorellaspp.)各2种,典型行业废水选用具有中国特色的4类废水(焦化废水、制药废水、印染废水和城市污水处理厂进出水),考察不同微藻对不同行业废水的毒性响应及其对不同组分废水的敏感性,从而为废水急性毒性评价中受试藻种的选择提供基础数据和实验依据。
1.1 实验材料
实验用水:焦化废水(2014年5月取自大连某钢铁厂生产工段的蒸氨废水,COD浓度为2 000 mg· L-1左右);制药废水(2014年7月取自福建莆田某制药厂生产废水,该厂主要产品为核糖核酸,COD浓度为2 000 mg·L-1左右);印染废水(2014年6月取自广东佛山某印染厂生化处理后出水,废水中有毒成分以染料、助剂为主,COD浓度为370 mg·L-1左右);城市污水处理厂废水(2014年12月取自大连某城市污水处理厂进出水,该废水以生活污水为主,COD浓度分别为218 mg·L-1和40 mg·L-1)。
实验用藻:斜生栅藻(Scenedesmus obliquus,标号为FACHB-417)和蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa,标号为FACHB-9)购自中国科学院水生生物研究所;等鞭金藻(Isochrysis galbana)和海水小球藻(Chlorellaspp.)由国家海洋环境检测中心友情提供。
1.2 废水理化指标测定方法
COD采用重铬酸钾滴定法,氨氮采用纳氏试剂光度法,硝氮采用酚二磺酸光度法,亚硝氮采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法,总磷采用钼锑抗分光光度法,色度采用稀释倍数法,溶解氧使用便携式溶解氧测定仪(METTLER TOLEDO FG4),pH使用德国Sartorius PB-20型pH测定仪。
1.3 藻类毒性实验方法
淡水微藻选择水生四号培养基,海水微藻选择CONWAY培养基。接种海水微藻时,营养盐与灭菌海水的比例为1:1 000,等鞭金藻还需按千分之一的比例加入维生素营养液(VB120.5 mg+VH 0.5 mg+ VB1100 mg+l 000 mL蒸馏水)。培养条件按OECD 201指南进行:温度25℃,光照比12 h:12 h,平均光照强度5 000 lux,每天定时摇动3次。微藻的接种和毒性实验均在无菌操作下进行。
藻类的毒性实验过程按照OECD 201指南进行:实验在500 mL的锥形瓶中进行,测试液体积总和为100 mL。选择处于对数生长期的微藻作为实验用藻;先通过预实验确定实验用水的浓度范围,正式实验设置至少5个梯度浓度和1个空白,每一浓度设置3组平行;分别在微藻暴露24 h和72 h取样测定藻液的吸光值(optical density,OD)。通过微藻的吸光度与细胞数的标准曲线确定微藻细胞数。微藻的生长抑制率按照OECD 201指南中的公式(1)、(2)计算:
式中,Nt,t时间微藻细胞数;N0,微藻初始细胞数。
1.4 数据处理
利用EC50软件(蓝宙软件开发公司,1.01版本)计算半数效应浓度(concentration for 50%of effect,EC50);利用SPSS软件,nonpara-mtric tests中的Mann-Whitney U检验进行差异性分析(P>0.05)。
2.1 废水理化指标
实验用各行业废水相关理化指标见表1。
2.2 焦化废水对4种微藻的急性毒性效应
根据预实验结果,选用不同稀释浓度的水样(对于斜生栅藻与蛋白核小球藻:22.2%、25%、28.6%、33.3%和40%;对于海水小球藻:14.3%、16.7%、20%、25%和3.3%;对于等鞭金藻:8.3%、9.1%、10%、11.1%和12.5%)对4种微藻进行急性毒性实验,微藻在24 h和72 h的生长抑制情况如图1和2所示。
焦化废水对斜生栅藻、蛋白核小球藻、海水小球藻、等鞭金藻的24 h和72 h急性毒性的EC50见表2。
由表2可见,焦化废水对斜生栅藻、蛋白核小球藻、海水小球藻在24 h和72 h的EC50值比较接近,而等鞭金藻在24 h和72 h的EC50值最低,说明在所用受试微藻中等鞭金藻对焦化废水的敏感性最强。
另外,对微藻在24 h和72 h的生长抑制情况数据进行差异性检验,结果表明,随着暴露时间的延长,微藻对焦化废水在24 h和72 h的毒性效应无显著性差异。
2.3 制药废水对4种微藻的急性毒性效应
根据预实验结果,选用浓度为50%、25%、16.67%、12.5%、10%、5%、3.33%和2.5%的水样进行急性毒性实验,不同微藻在24 h和72 h的生长影响情况如图3所示。
图1 焦化废水对4种微藻生长抑制率(24 h)
图2 焦化废水对4种微藻的生长抑制率(72 h)
图3 制药废水对4种微藻的生长抑制率(24 h和72 h)
表2 焦化废水对4种微藻的EC50(24 h和72 h)Table 2 EC50of the four microalgae in coking wastewater after 24 h and 72 h
图4 印染废水对4种微藻的生长抑制率(24 h和72 h)
图5 城市污水处理厂进出水对4种微藻的生长抑制率(24 h和72 h)
由图3可见,制药废水对不同微藻的影响情况不同,并且差别较大。随着水样浓度的增大,水样对斜生栅藻、蛋白核小球藻和海水小球藻的影响情况基本呈现先增强后减弱的趋势,其中浓度为16.67%和12.5%的水样对微藻的影响最大。在所用的4种受试藻类中,斜生栅藻的生长抑制情况随水样浓度的变化最为显著,其对制药废水的毒性最为敏感;而等鞭金藻的生长抑制情况随水样浓度的变化最不明显,其对制药废水毒性的敏感性相对稳定。
随着暴露时间的增长,4种微藻的生长变化情况也有所不同。由图3可见,在水样浓度为16.67%、12.5%和10%时,废水对海水小球藻的生长促进作用在72 h和24 h有明显的差异,而对其他3种受试藻类的影响差异较小。
2.4 印染废水对4种微藻的急性毒性效应
根据预实验结果,选用浓度为100%、25%、12.5%、6.25%和3.125%的水样进行急性毒性实验,不同微藻在24 h和72 h的生长影响情况如图4所示。
由图4可见,实验用低浓度的印染废水对4种微藻的生长起促进作用,但影响效果较小。随着水样浓度的降低,印染废水对斜生栅藻和等鞭金藻24 h和72 h的生长影响作用变化不大(生长抑制率在-10%左右),而对蛋白核小球藻和海水小球藻24 h和72 h的生长影响呈逐渐减弱的趋势。
同时,对比24 h和72 h的实验数据可以发现:印染废水对斜生栅藻、蛋白核小球藻、等鞭金藻的促进生长影响作用随暴露时间的增加变化不大,而对海水小球藻的生长促进作用随暴露时间的增加变化比较明显,这表明海水小球藻对印染废水的毒性效应较为敏感。
2.5 城市污水处理厂进出水对4种微藻的急性毒性效应
选择马栏河城市污水处理厂的进出水进行藻类急性毒性实验,不同微藻在24 h和72 h的生长影响情况如图5所示。
由图5可见:污水处理厂进水对4种微藻的生长影响作用较为明显(24 h时的影响作用范围为-13.53%~-51.38%,72 h时的影响作用范围为-15.96%~51.32%)。进水对等鞭金藻的生长影响与其他3种藻类有所区别:72 h时,污水处理厂进水对其的生长影响作用由24 h的促进作用变为抑制作用(抑制率达到55%)。污水处理厂出水对4种微藻的生长影响作用较小(24 h时的影响作用范围为-27.3%~4.11%,72 h时的影响作用范围为-23.88%~3.51%)。出水对4种微藻的生长影响无明显差别。
对比进出水对藻类的生长影响作用可以看出,出水对4种微藻的生长影响作用都有所降低,这说明城市污水处理厂能在一定程度上去除废水对微藻的毒性。同时,对比4种微藻的生长影响作用结果可以看出,进出水对海水小球藻的影响作用有较大差异,这表明海水小球藻对于城市污水处理厂进出水的毒性效应相对敏感。
3.1 废水对藻类生长的影响
在本文中是这样定义藻类的毒性作用的:藻类在废水暴露过程中的生长情况跟控制组有显著性差异,就认为废水对藻类有毒性。本实验选用的焦化废水和制药废水,属于高COD浓度有机废水,但是对4种微藻的生长表现出不同的影响作用:焦化废水表现出抑制生长作用,而制药废水表现出促进生长作用。其中,由于本研究所用焦化废水中的氨氮含量较高,而总磷含量偏低(具体数据见表1),N与P的比例不能提供适合微藻生长的条件;同时,其中含有的大量诱变毒性和致癌毒性的有机物会抑制微藻生长,所以焦化废水对微藻的生长影响表现为抑制生长作用,并且其对数浓度与微藻生长抑制率表现出较好的线性相关性(图1和2所示)。而本研究所用的制药废水中含有一定比例的N、P等营养元素(具体数据见表1),可供微藻迅速生长,对微藻的促进生长作用远远超过水样中有毒物质对微藻的抑制生长作用,因此制药废水对微藻的生长影响表现为促进生长作用,且随着浓度的增加,制药废水对微藻生长的促进作用表现为先增加后减弱的趋势(图3所示)。
本实验所用的印染废水和城市污水处理厂废水,属于低COD浓度废水,其对各微藻基本表现出促进生长作用。这是因为本研究所用的废水为某印染厂生化处理后出水和城市污水处理厂污水,水样中的致毒有机物的含量较低,并且N、P等营养物质的浓度适合微藻生长(具体数据见表1),在污染物和营养物质共同作用下,废水对微藻的生长表现为促进效应[6,24-25]。微藻的过度繁殖,虽然有可能提供给人类蛋白质、生物能源等可利用资源,但是也可能产生危害人类健康的藻毒素[26]或者造成水体的富营养化。因此,合理控制废水的生物毒性,对于控制微藻的过度繁殖以及接受水体的水生态安全具有至关重要的意义。
3.2 色度对藻类生长的影响
大多数的行业废水都具有一定的色度,而色度是影响藻类生长的因素之一。在水样色度较大的情况下,水样吸收了来自外界的光源,使微藻无法得到正常生长所需的光线,从而影响微藻的光合作用,因此在研究废水对微藻的毒性效应时,要注意水样色度对实验结果的影响。例如,本实验在研究制药废水对蛋白核小球藻的毒性效应时,浓度为50%的制药废水对蛋白核小球藻的生长抑制率高达106%,而浓度为25%的制药废水对蛋白核小球藻表现出促进生长作用,促进生长率达到35.86%,这说明水样浓度达到25%时,色度对微藻生长的影响明显减弱。同时,采用吸光度法来测定微藻的细胞浓度时,由于制药废水色度的存在会干扰吸光度的测定结果,因此本研究中采用离心的方法,减少了色度对水样吸光度测定的干扰,从而减少了由于实验方法引起的相对误差。另外,也可考虑用其他的指标如叶绿素含量、蛋白质含量、酶的活性[27]等来表征微藻的生物量。
3.3 废水排放指标的控制
目前的排放标准中,缺乏表征水质毒性的相关指标。例如,排放标准中规定排放废水的COD浓度在40 mg·L-1~50 mg·L-1左右,因此有些企业采用简单的稀释法来降低排放废水的COD浓度使其达标。但是,本研究的实验结果表明,简单的稀释法只能部分降低废水对微藻的急性毒性。例如,本研究中制药废水浓度为2.5%时COD浓度达到50 mg· L-1左右,达到排放标准,但是其对蛋白核小球藻的促进生长率仍然达到20%。综上所述,工业废水通过稀释的方式并不能完全消除废水对生物(微藻)的急性毒性,必须结合深度处理技术对其毒性做进一步的去除。如刘薇等[28]利用光电催化技术对水中五氯酚的毒性特征进行了研究,结果表明光电催化降解五氯酚的过程中溶液毒性逐步降低。目前,本研究小组利用Fenton氧化技术对焦化废水进行处理,与简单的稀释法相比,Fenton氧化法可以有效去除焦化废水对微藻的急性毒性。
3.4 受试藻种的选择
对于废水毒性试验中受试物种的选择,藻类作为受试物种之一,被广泛应用于废水的急性毒性实验研究。对于同一行业废水的藻类毒性评价,本研究所采用的4种微藻中,等鞭金藻对焦化废水的敏感性最强,原因可能是等鞭金藻没有细胞壁,细胞裸露,更容易被污染物侵染而死亡;而海水小球藻对低浓度的印染废水和城市污水厂的进出水都表现出较强的敏感性,其原因可能是由于海水小球藻个体小,细胞呈球形,光合作用极强,更容易吸收水样中的营养物质而迅速繁殖。对于不同行业废水毒性的对比研究,受试微藻的选择是影响评价结果的主要因素之一。在本研究中,等鞭金藻对焦化废水敏感性最强,但其对于制药废水和印染废水却相对稳定,而海水小球藻不仅对印染废水和城市污水相对敏感,对不同浓度的焦化废水和制药废水也表现出较好的毒性响应,因此海水小球藻可以用于本研究中选用的行业废水的毒性比较。综上可知,为获得快速有效的废水毒性测试方法,必须要考虑所选用的受试微藻对不同行业废水的敏感性。本研究的结果为行业废水急性毒性评价中受试藻种的选择提供了基础数据和实验依据。
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Comparative Study on Acute Toxic Effect Response of Four Microalgae to Typical Industrial Wastewaters
Zhang Ying*,Wang Siyang,Zhang Xilong,Wang Dongzhou,Zhou Siyun,Zhou Jiti
Key Laboratory of Industrial Ecology and Environmental Engineering(MOE),School of Environmental Science and Technology, Dalian University of Technology,Dalian 116024,China
13 August 2015 accepted 26 October 2015
To evaluate the sensitivity of varied microalgae to typical wastewater,acute toxicity tests with four species of microalgae-Scenedesmus obliquus,Chlorella pyrenoidosa,Chlorellaspp.andIsochrysis galbanawere investigated using the algal growth inhibition test during 24 h and 72 h.Coking wastewater and pharmaceutical wastewater were used as the representative ones with high concentration of COD,while dying wastewater and municipal wastewater as the ones with low concentration of COD in this study.The results revealed thatIsochrysis galbanaexpressed the highest growth inhibition in coking wastewater,whileScenedesmus obliquusin the pharmaceutical wastewater,andChlorellaspp.in both dying wastewater and municipal wastewater.It can be seen that there are differences in sensitivity to the toxicity of different wastewaters among these four microalgae.It aids to the choice of test aquatic organisms in the toxicity evaluation of wastewater.
coking wastewater;dying wastewater;pharmaceutical wastewater;municipal wastewater;microalgae; bio-toxicity evaluation
2015-08-13 录用日期:2015-10-26
1673-5897(2016)3-092-09
X171.5
A
10.7524/AJE.1673-5897.20150813001
国家自然科学基金重大国际合作研究项目(NSFC-JST,21261140334);国家水体污染控制与治理科技重大专项(2012ZX07202-006)
张瑛(1972-),女,博士,副教授,研究方向为水生态风险评价及健康风险评价,E-mail:yzhang@dlut.edu.cn