样品溶剂对高效液相色谱分析结果的影响

崔连喜，张肇元，吴宇峰，王艳丽，李利荣，王　静

(天津市环境监测中心，天津　300191)



样品溶剂对高效液相色谱分析结果的影响

崔连喜，张肇元，吴宇峰，王艳丽，李利荣，王静

(天津市环境监测中心，天津300191)

结合日常样品监测工作，针对相同条件下，以乙腈作为流动相，对三种常用溶剂下的苯并[α]芘进行了对比试验，实验表明：三种常用溶剂的洗脱能力由强到弱为二氯甲烷、乙腈、甲醇。由于溶剂极性的不同对样品的保留时间以及响应值产生了影响。在高效液相色谱方法的开发和应用中，应尽量使用与流动相比例相同或者相近的溶剂溶解样品，以消除影响。

高效液相色谱；流动相；样品溶剂；苯并[α]芘

高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography/HPLC)是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。近年来，其凭借分辨率高、分析速度快和应用范围广等优点收到了仪器分析工作者广泛关注。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。目前，大多数研究者往往把关注点放在样品的前处理方法和流动相的选择上，但忽视了样品溶解所用溶剂对整个实验结果的影响。解决这种影响最好的办法就是使用流动相作为样品的溶剂，这样既减少了样品分析基线的不稳定性，又能避免流动相和样品溶剂间因极性不同所造成的保留时间偏移、响应值波动等影响[1-3]。

本次测定的物质为苯并[α]芘(benzo(α)pyrene)，是一种公认强致癌物质。常温下呈浅黄色晶状固体，难溶于水，易溶于苯、甲苯、丙酮、己烷等有机溶剂，碱性情况下稳定，遇酸易发生化学变化。目前，已发现致癌化学物质约有450种，其中200种属于多环芳烃类化合物，苯并[α]芘是其中强致癌代表性物质[4-5]。目前测定苯并[α]芘的方法主要有高效液相色谱法、纸层析―荧光分光光度法和气质联用法。

本文结合日常样品检测工作，针对相同条件下，以乙腈作为流动相，对几种常用溶剂下的苯并[α]芘进行了对比试验，并探讨溶剂效应的形成原因及对色谱分析的影响。

1　实　验

实验仪器：安捷伦1260高效液相色谱；色谱柱，PAH柱；实验试剂：甲醇，色谱纯；二氯甲烷，色谱纯；乙腈，色谱纯；苯并[α]芘标液：20 mg/L。

色谱条件：流动相流量为1.20 ml/min，开启紫外和荧光检测器，流动相A为水，流动相B为乙腈；按表1程序进行梯度洗脱。

表1　梯度洗脱程序Table 1　Gradient elution

2　结果与讨论

2.1不同溶剂苯并[α]芘保留时间的对比

不同溶剂苯并[α]芘的保留时间如表1所示。在反相色谱系统里，溶剂强度顺序：水<甲醇<乙腈<二氯甲烷。当样品用非流动相溶剂溶解时，样品在进入色谱柱之前，会先富集在柱前端，然后才会被流动相快速洗脱。此时样品溶剂在柱内可以看作流动相的一部分，当溶解样品的溶剂洗脱强度大于流动相时，其作为洗脱力强的流动相，样品的溶剂带在色谱柱中迁移更快，从而保留时间更短。

表2　不同溶剂苯并[α]芘的保留时间Table 2　The retention time of benzoapyrene in different solvents

2.2不同溶剂苯并[α]芘测定浓度的对比

将浓度为20mg/L的苯并[α]芘标液分别用甲醇、乙腈、二氯甲烷三种不同溶剂稀释4000倍、400倍、40倍和4倍得到浓度为5 μg/L、50 μg/L、500 μg/L、5000 μg/L的稀释液在乙腈和水作为流动相的条件下进行对比试验。每种溶剂每个浓度重复六次进样取平均值。

图1　浓度为5 μg/L的各种溶剂重复三次的测试浓度Fig.1　Test concentrations of the various solvents triplicate at a concentration of 5 μg/L

由图1可以看出浓度为5 μg/L的苯并[α]芘在甲醇、乙腈、二氯甲烷作为溶剂下的平均测试浓度分别是：4.67 μg/L、4.98 μg/L、5.25 μg/L，与原浓度相差分别在6.6%、0.4%、5.0%。

图2　浓度为50 μg/L的各种溶剂重复三次的测试浓度Fig.2　Test concentrations of the various solvents triplicate at a concentration of 50 μg/L

由图2可以看出浓度为50 μg/L的苯并[α]芘在甲醇、乙腈、二氯甲烷作为溶剂下的平均测试浓度分别是：52.2 μg/L、50.6 μg/L、56.1 μg/L，与原浓度相差分别在4.4%、1.2%、12.2%。

图3　浓度为500 μg/L的各种溶剂重复三次的测试浓度Fig.3　Test concentrations of the various solvents triplicate at a concentration of 500 μg/L

由图3可以看出浓度为500μg/L的苯并[α]芘在甲醇、乙腈、二氯甲烷作为溶剂下的平均测试浓度分别是：526 μg/L、500 μg/L、557 μg/L，与原浓度相差分别在5.2%、0%、11.4%。

图4　浓度为5000 μg/L的各种溶剂重复三次的测试浓度Fig.4　Test concentrations of the various solvents triplicate at a concentration of 5000 μg/L

由图4可以看出浓度为5000 μg/L的苯并[α]芘在甲醇、乙腈、二氯甲烷作为溶剂下的平均测试浓度分别是：4758 μg/L、4921 μg/L、5746 μg/L，与原浓度相差分别在4.8%、1.6%、14.9%。

在乙腈和水作为流动相的条件下，苯并[α]芘标液分别用甲醇、乙腈、二氯甲烷三种不同溶剂稀释至浓度为5 μg/L、50 μg/L、500 μg/L、5000 μg/L，所测浓度偏差范围分别是4.4%～6.6%、0%～1.6%、5.0%～14.9%。

实验表明：当样品溶剂与流动相相同时会使溶剂效应降到最低甚至接近于无影响。同时使用溶剂与流动相的极性差别越大，结果受到的影响也会越大。并且在相同实验条件下随着样品浓度的增大，结果的偏差有进一步增大的趋势。出现上述状况的主要原因是不同的样品溶剂，在柱内与流动相混合使极性出现偏差，导致紫外吸收差异，响应值受到影响。液相色谱一般进样量为10 μL，柱子中局部流动相量比较小，当样品溶液进入柱子，10 μL体积会改变局部的流动相环境(强度)，从而可能出现峰变形致使峰面积发生变化，导致结果差距较大。

3　结　论

当溶解样品的溶剂洗脱强度大于流动相时，其作为洗脱力强的流动相，样品的溶剂带在色谱柱中迁移更快，从而保留时间更短。

当样品溶剂与流动相相同时会使溶剂效应降到最低甚至接近于无影响。同时使用溶剂与流动相的极性差别越大，结果受到的影响也会越大。并且随着样品浓度的增大，结果的偏差有进一步增大的趋势。所以在检测分析前期，分析者应该充分了解样品的稳定性和溶解性，并且在考虑方法成本和样品稳定性的同时尽量选择流动相或者相近性质的溶剂溶解样品，这样不仅减小基线的不稳定性，而且能确保样品测定结果的精确度和正确度，减少容积效应的影响。

[1]徐作刚,段萍,邓巧云,等．盐酸环丙沙星片含量测定中使用不同稀释溶剂对峰面积的影响[J]．黔南民族医专学报，2005,18(2):71-72．

[2]中国药典.二部[S]. 2005:525-526．

[3]L R 施奈德，J L 格莱吉克．实用高效液相色谱法的建立.2版[M]．北京：科学出版社,1998:253-253．

[4]段小丽,魏复盛. 世界科技研究与发展[J]. 院士论坛，2003,24(1):11-17.

[5]周芳,孙成,钟明. 我国水体中苯并芘污染的生态风险评价[J].环境与健康杂志,2005,22(3):163-165.

Effect of Sample Solvent on the Analytical Results of High Performance Liquid Chromatography

CUILian-xi，ZHANGZhao-yuan，WUYu-feng，WANGYan-li，LILi-rong，WANGJing

(Tianjin Environment Monitoring Center，Tianjin 300191，China)

Combining daily sample monitoring, under the same conditions, the benzene[α]pyrene of three kinds of solvents was compared with acetonitrile as mobile phase. Experimental results showed that the elution ability of three kinds of common solvents from strong to weak was dichloromethane, acetonitrile and methanol. The retention time and the response value of the samples were affected by different solvent polarity. In the development and application of chromatographic methods, the samples should be dissolved with mobile phase or similar solvent as could as possible, so as to eliminate the effect.

high performance liquid chromatography; mobile phase; sample solvent

崔连喜(1987-)，男，工程师，研究方向：环境监测。

X832

A

1001-9677(2016)018-0157-03