腐烂龙须菜自水解生产琼胶寡糖的可行性研究*

朱思颖，陈丹琦，梁家铭，李海新，李　蓉，柯德森

(广州大学生命科学学院，广东　广州　510006)



腐烂龙须菜自水解生产琼胶寡糖的可行性研究*

朱思颖，陈丹琦，梁家铭，李海新，李蓉，柯德森

(广州大学生命科学学院，广东广州510006)

在不同温度、供氧量、盐度及处理时间条件下，对腐烂龙须菜的还原糖含量、琼胶酶活力及分子量进行分析，以探究龙须菜腐烂过程中自水解生产琼胶寡糖的可行性，并分析影响其水解程度因素。实验表明，腐烂龙须菜中有一种活性物质能降解琼胶生产琼胶寡糖。35 ℃、淡水半厌氧、腐烂处理96 h时的龙须菜产琼胶寡糖含量为“完好”样品近6倍，酶活力是0 h酶活力的约8.2倍。该条件下处理48 h的腐烂龙须菜的小分子琼胶寡糖的相对含量达98.71%。

龙须菜；腐烂；琼胶酶；琼胶寡糖；分子量

琼胶在工业生产中应用非常广泛，却不能人工合成，只能从产琼胶红藻中提取。而龙须菜是江蓠属海藻中提取琼胶质量最好的种类之一，其琼胶含量达20%～25%，琼胶凝胶强度可达1000 g·cm-2以上。

琼胶在食品、医药卫生、日用化工、轻工业等方面有广泛的应用[1]。但由于琼胶凝动性强，不容易被吸收，因此在应用方面受到很大限制。而琼胶经酸水解后主要形成由琼二糖的重复单位连接而成的寡糖，即琼胶寡糖，水溶性好，有利于人体吸收，是一种新型的海洋功能性低聚糖[2]，因此琼胶寡糖的研究成为新的热点。

目前琼胶寡糖虽然在食品、医药、生物等许多方面有广阔应用前景，但琼胶寡糖至今还没有进行产业化的生产[3-4]。而到目前为止，实现降解琼胶生产琼胶寡糖的琼胶酶工业化生产的菌株只有大西洋假单胞菌，其产品来自于Sigma公司，价格昂贵，而我国尚没有琼胶酶的产品[5-8]。

本实验充分利用低成本的腐烂龙须菜，用单因素法探究腐烂龙须菜的天然琼胶酶降解琼胶产琼胶寡糖的可行性及将腐烂龙须菜不同温度、供氧量、海水与淡水、时间等条件腐烂处理下对琼胶寡糖含量进行对比研究，目的是探究较高产量的应用价值高的琼胶寡糖生产的最适条件，因此经济利用价值十分高。

1　实　验

1.1实验材料和试剂

新鲜龙须菜：2016年1月购于广东省南澳岛，用清水冲洗干净后用海水浸泡、氧气泵供氧备用。海水[9]：每100 mL水含3.5 g海盐配制。3,5-二硝基水杨酸[10-11]：精确称取3,5-二硝基水杨酸40 g，溶于800 mL浓度为2 mol·L-1的NaOH溶液中，加入2000 mL蒸馏水，再加入1200 g的酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至4000 mL。Tris-HCl缓冲液。0.2%琼胶溶液：琼脂粉，天津市致远化学试剂有限公司，Tris-HCl缓冲液溶解。

1.2培养环境因素对腐烂龙须菜的处理

1.2.1温度处理

称取120 g新鲜龙须菜用蒸馏水稍微冲洗，用酒精消毒后的小刀切断龙须菜(100次)，平均分成3份均匀置于3个大小一致干净烧杯中，分别标志为：“损伤25 ℃”、“损伤35 ℃”、“损伤45 ℃”。隔24 h测一次还原糖含量，共测3次。(对照为海水浸泡、氧气泵供氧的备用龙须菜，测量时标志为“完好”，以下简写为“完好”龙须菜。)

1.2.2供氧量、海水与淡水处理

在温度处理的结果的基础上，选出合适的温度进行如下操作：称取240 g新鲜龙须菜用蒸馏水稍微冲洗，用酒精消毒后的小刀切断龙须菜(200次)，平均分成6份后均匀置于6个大小一致的干净烧杯中，其中3个烧杯中加入600 mL淡水，另外3个加入配制好的600 mL海水，从海水和淡水处理的烧杯中各取3个烧杯分别用保鲜膜密封、敞开、用氧气泵供氧，用于提供利于海水厌氧、淡水厌氧、海水半厌氧、淡水半厌氧、海水好氧、淡水好氧的微生物生长环境。测定腐烂培养24 h和48 h的还原糖含量以确定最适条件。(对照 “完好”龙须菜)

1.2.3最适培养时间实验

以上两实验得出的最适条件为基础，重新称取120 g新鲜龙须菜用蒸馏水稍微冲洗，用酒精消毒后的小刀切断龙须菜(100次)后适宜条件培养，在腐烂培养时间为15 h、24 h、40 h、49 h、64 h、73 h、87 h、96 h时测定腐烂龙须菜样品和“完好”龙须菜还原糖含量。(对照为 “完好”龙须菜)

1.3腐烂龙须菜提取液的天然琼胶酶活力测量[12]

称取约100 g新鲜龙须菜材料用蒸馏水冲洗，用酒精消毒后的小刀切断龙须菜，置于干净的烧杯中，加淡水浸泡龙须菜至刚好覆盖，分别在培养0 h、24 h、48 h、64 h、96 h、108 h、120 h、132 h取提取液与琼胶溶液混合(提取液:0.2%琼胶溶液=8:2)后，马上取0.5 mL提取液与琼胶溶液的混合液于3支有刻度的试管中，测定还原糖OD值。剩下的混合液置于培养箱中酶解24 h后测定酶解后的还原糖OD值。以酶解前后还原糖OD值的变化量衡量酶活力的大小。

还原糖OD值测定方法如下：取0.5 mL溶液，加入0.5 mL蒸馏水后加入2 mL DNS，煮沸10 min，冷却，定容到7.5 mL，在520 nm下测吸光度，依据葡萄糖标准曲线计算粗酶活。以反应体系中1 min产生0.001 μg还原糖所加入的酶量为一个活力单位。

1.4龙须菜还原糖含量的测定[10-11]

将龙须菜分别称取10 g于烧杯中，用75%酒精消毒过的剪刀剪碎至各份龙须菜的剪碎程度接近，用研钵研磨充分形成浆，分别加入100 mL蒸馏水。置于100 ℃水浴锅水浴30 min，搅拌，真空抽滤，保留滤液。每一份滤液取分别取1 mL至3支有刻度的试管中，并加入2 mL DNS溶液，100 ℃水浴煮沸10 min以后，定容到7.5 mL，用分光光度计在520 nm波长下比色测定光密度。

1.5还原糖的分子量鉴定[13-18]

取样品5 mL，加入50 mL蒸馏水稀释，加热并搅拌使其充分溶解，冷却至室温后经0.45 μm滤膜过滤备用。利用凝胶过滤GPC-HPLC (岛津LC20A，日本岛津公司)进行分子量范围测定，GPC色谱柱RBL2054；流动相为纯净水，使用前经0.45 μm滤膜过滤，流速1 mL·min-1；柱温30 ℃，示差折光检测器温度30 ℃；进样量：9 μL。

1.6实验数据处理

以上实验重复次数均为3，取平均值并计算标准误差(SE)，实验结果表示为：平均值 ±SE。

2　结果与讨论

2.1培养温度对龙须菜还原糖产量的影响

图1可知，任一时刻下25 ℃、35 ℃、45 ℃下腐烂龙须菜的还原糖含量均比无损伤腐烂处理的龙须菜的还原糖含量高，且35 ℃与45 ℃下培养下的还原糖含量更高，这与梅建凤等[3]的研究结果接近，其中45 ℃培养的腐烂龙须菜24～72 h时还原糖含量上升较快，72 h时还原糖含量为24 h时的2.8倍，25 ℃、35 ℃下培养的腐烂龙须菜在48～72 h之间还原糖含量呈明显上升趋势；猜测与产琼胶酶的微生物生长繁殖的最适温度以及酶活性发挥的最适温度有关。考虑到生产成本的因素，故选取35 ℃温度下，进行不同氧气和水条件处理龙须菜的还原糖含量的环境条件探究。

图1　腐烂龙须菜在不同温度下还原糖含量随时间的变化曲线Fig.1　Change of reducing sugar content in rotten asparagus at different temperaturesvaried with time 注：图中数据为三组平行实验的平均值， 其中垂直短线表示实验的标准偏差

2.2溶氧量和水的盐度对还原糖含量的影响

图2　不同氧气和水条件处理还原糖含量随时间的变化Fig.2　Change of reducing sugar content in different oxygen and water conditions

由图2可知，损伤腐烂处理的龙须菜培养48 h的还原糖含量均比24 h高，且条件为淡水、半厌氧条件处理的腐烂龙须菜的还原糖含量最高，而淡水厌氧条件处理的腐烂龙须菜还原糖含量次之，可初步确定产琼胶酶的微生物适于生长在淡水、半厌氧条件，为半厌氧微生物。因此选取淡水、半厌氧条件为最适条件。

2.3培养时间对龙须菜还原糖含量的影响

图3结果可知，35 ℃、淡水、半厌氧条件下培养的腐烂龙须菜上还原糖含量明显比对照的“完好”样品的还原糖含量高；在15～40 h时，还原糖含量呈指数上升，64 h后趋于平稳上升，在实验时间内，培养时间为96 h的腐烂龙须菜上还原糖含量是对照样品近6倍。因此35 ℃、淡水半厌氧的条件更利于腐烂龙须菜上还原糖的积累。

图3　35 ℃、淡水、半厌氧处理腐烂龙须菜还原糖含量随时间的变化Fig.3　Changes of reducing sugar content at 35 ℃ in fresh water and half rotten asparagus anaerobic treatment with time

2.4腐烂龙须菜天然琼胶酶活力验证

根据图4结果可见，腐烂龙须菜的琼胶酶活力在龙须菜腐烂0～96 h呈上升趋势，96 h时酶活力达到最大后开始下降，其上升趋势与图3所示结果相吻合。培养时间为96 h提取液酶活力是0 h时约8.2倍。对0 h、48 h和96 h的酶活力进行单因素方差分析，计算结果显示，说明龙须菜腐烂处理0 h、48 h、96 h之间酶活力差异达极显著水平， 96 h时的酶活力极显著大于0 h和48 h，结果证明腐烂龙须菜的提取液中存在具琼胶酶活性物质，促进琼胶水解产生琼胶寡糖。

图4　腐烂龙须菜酶活力随时间变化图Fig.4　Gracilaria decay of enzyme activity over time

2.5还原糖分子量测定结果

将GPC高效液相色谱法所测还原糖的保留时间划分为3部分：其中保留时间为3～6 min为大分子量，保留时间为7～10 min为中分子量，保留时间11～14 min部分为小分子量。其中，小分子量的还原糖可初步认为是琼胶寡糖。以各部分峰面积占总波峰面积的百分比(%)近似表示该部分分子量的可溶性糖的相对含量，结果如表1所示。对“完好”、海水半厌氧、淡水半厌氧的小分子量相对含量进行单因素方差分析，结果为P=4×10-15<<0.01，说明不同条件处理腐烂龙须菜所得小分子量的相对含量的差异达极显著水平，其中淡水半厌氧处理条件下小分子量达到98.71%,为未经处理的“完好”龙须菜的近8倍，证明淡水、半厌氧条件下培养腐烂龙须菜自水解生产的琼胶寡糖最多，与上述实验结果均吻合。

表1　液相色谱法测定不同条件处理腐烂龙须菜 所得分子量分布表Table 1　Liquid Chromatography different processing conditions rotting asparagus dish molecular weight distribution of the resulting table

3　结　论

本实验探究了腐烂龙须菜是否能通过自水解生产应用价值高的琼胶寡糖，实验证实了在适宜条件下，腐烂龙须菜能产生一种活性物质，这种活性物质使腐烂龙须菜自水解生产海洋功能性低聚糖——琼胶寡糖。

本实验通过改变温度、溶氧量、水盐度、培养时间等条件，测定腐烂龙须菜上还原糖的含量(通过测定还原糖OD值并绘制还原糖标准曲线，标准曲线为：y=2.1802x，R2=0.9927)初步确定损伤腐烂处理能增大琼胶寡糖的产量，进一步通过腐烂龙须菜提取液的天然琼胶酶活力验证，证实了腐烂龙须菜能产生一种活性物质，这种活性物质可能是一种琼胶酶，能促进水解琼胶生产还原糖，而这种还原糖最终通过还原糖的分子量测定初步鉴定为琼胶寡糖。本实验探索并得到腐烂龙须菜生产琼胶寡糖的相对合适条件，推测该条件适合产琼胶酶的微生物的生长并使其产生的琼胶酶活性更高。实验结果表明：在35 ℃左右、淡水、半厌氧条件下，琼胶寡糖在腐烂龙须菜培养时间小于96 h时产量呈上升趋势，15～40 h时呈指数增长，64～96 h平稳上升且96 h时产量达到最高，为对照的“完好”样品的近6倍；龙须菜腐烂处理时间为96 h提取液的酶活力是0 h提取液酶活力约8.2倍，而被小分子量琼胶寡糖相对含量在淡水半厌氧处理下为未经处理的“完好”龙须菜的近8倍。此结果对将来进一步放大生产琼胶寡糖具有重要的参考价值。

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Feasibility Study of Agar Oligosaccharide Production by Self Hydrolysis during Decay Process inGracilariaLemaneiformis*

ZHUSi-ying,CHENDan-qi,LIANGJia-ming,LIHai-xin,LIRong,KEDe-sen

(School of Life Sciences, Guangzhou University, Guangdong Guangzhou 510006, China)

Under the conditions of different temperature, the amount of oxygen, salinity and treatment time, the content and the molecular weight of reducing sugar were measured, as well as the agarase activity inGracilarialemaneiformiswas analyzed during decay process. The feasibility study of agar oligosaccharide production by self hydrolysis during decay process inGracilarialemaneiformiswas studied and the related factors affecting the degree of hydrolysis were analyzed. The results showed that the agar could be degraded to produce agaro oligosaccharides during decay process inGracilarialemaneiformis. The agar oligosaccharide content in 96 h was 6 times as much as that of the natural species. The enzyme activity in 96 h was 8.2 times as much as that in 0 h. The small molecule agarose content could reached 98.71% when Gracilaria rotted in fresh water at 35 ℃ for 48 h.

Gracilarialemaneiformis; rot; agarase; agar oligosaccharide; molecular weight

广东省自然科学基金项目(2014A030313531)；广州市科技计划项目(201510010108)；广东省专业综合改革试点项目(生物工程, 粤教高函[2013]113号)；2016广东省级大学生创新训练项目(教务〔2016〕58号)；第十五届全国“挑战杯”竞赛立项(2016：琼胶寡糖)。

朱思颖(1993-)，本科生。

柯德森(1966-)，博士，教授。

S985.4+9

B

1001-9677(2016)018-0052-04