19份苜蓿种质遗传多样性的ISSR分析

王健胜，侯桂玲，程立平，谢永凤

(1. 平顶山学院，河南　平顶山　467000；2. 中国农业科学院草原研究所，内蒙古　呼和浩特　010010)



19份苜蓿种质遗传多样性的ISSR分析

王健胜1，侯桂玲1，程立平1，谢永凤2

(1. 平顶山学院，河南平顶山467000；2. 中国农业科学院草原研究所，内蒙古呼和浩特010010)

采用ISSR分子标记技术对19份国内外苜蓿种质的遗传多样性进行检测分析。12对ISSR引物在供试苜蓿材料中共获得有效扩增位点71个，其中多态性位点69个，多态性位点百分率为96.25%。引物的有效等位基因数、Nei′s基因多样性指数、Shannon′s信息指数和多态性信息含量平均分别为1.50、0.30、0.46和0.33。供试苜蓿材料的遗传相似系数介于0.296～0.887，平均为0.617，表明被研究苜蓿材料遗传异质性较好。聚类分析结果显示，供试材料在遗传相似系数0.522处可被划分为两大类，第1类群包括的苜蓿种质数达到17个，占到所有供试苜蓿种质总数的89.47%，第2类群包含的苜蓿种质数只有2个。主成分分析获得了与聚类分析基本一致的结论。

苜蓿；遗传多样性，ISSR分析

苜蓿MedicagoL.是世界上最重要的豆科牧草，俗称“牧草之王”[1]，具有适应性广、产量高、营养丰富、土壤固氮、改善生态环境等优点，已成为世界上种植面积最广的牧草之一。我国是世界上苜蓿主要种植国家之一。多样的气候特点使我国也成为世界上苜蓿种质资源较丰富的国家之一，而我国开展苜蓿种质创新利用的相关基础研究较少，这在很大程度上已限制了我国苜蓿优良品种的培育效率。目前，我国苜蓿品种无论在数量上还是品质上均无法满足生产的需求。因此，开展苜蓿种质资源研究已显得尤为重要。

苜蓿种质遗传多样性研究是苜蓿育种和遗传改良的基础。分子标记是以DNA多态性为基础的遗传标记，已经成为苜蓿种质资源评价和利用的有力工具。目前，包括AFLP[2]、RFLP[3]、RAPD[4-6]、SSR[7-8]等多种分子标记均被应用于苜蓿种质资源研究中。ISSR(Inter Simple Sequence Repeats)标记，即简单重复序列区间DNA标记，具有稳定性好，多态性高，试验操作简单、快速、DNA用量少等优点，因此该技术已成为研究苜蓿种质资源及遗传多样性的有效手段。张颖娟等[9]采用ISSR标记对12份苜蓿材料的遗传多样性进行了研究，结果表明，苜蓿的遗传分化主要发生在种群内，聚类分析结果认为，紫花苜蓿与杂花苜蓿的亲缘关系较近，而与黄花苜蓿的亲缘关系较远。刘磊等[10]利用ISSR分析了紫花苜蓿、黄花苜蓿和胡卢巴属植物的亲缘关系，结果发现，紫花苜蓿、扁蓿豆和黄花苜蓿有较广遗传基础，胡卢巴种质材料相对于紫花苜蓿种质材料与黄花苜蓿的亲缘关系更近。李红等[11]利用10个ISSR引物对30份苜蓿材料的遗传多样性进行了分析，发现该群体的遗传多样性水平较高，聚类分析结果将30份苜蓿材料划分为3个类群，第1类包括准格尔、敖汉、肇东等19份种质材料，金达苜蓿单独划分为1类，第3类包括和平、德宝等10份种质材料。ISSR也被用于苜蓿抗病材料的研究中，孟芳等[12]运用ISSR标记对苜蓿F1代抗褐斑病基因进行了研究，结果筛选到与苜蓿褐斑病紧密连锁的5个ISSR标记。

本研究采用ISSR分子标记技术对国内外19份苜蓿种质进行分子鉴定和比较分析，初步阐明供试种质的遗传多样性，以期为苜蓿种质资源的有效利用和优良苜蓿新品种培育提供一定理论依据。

1　材料与方法

1.1试验材料

本试验利用的苜蓿材料共有19份，具体信息详见表1。

1.2 DNA提取

每份材料随机选取10～15个单株幼嫩叶片等量混合，采用改良的SDS法[13]混合提取基因组总DNA，经紫外分光光度计测定浓度后，稀释至适合浓度用于苜蓿基因组PCR扩增检测。

1.3ISSR标记检测

PCR扩增反应在Eppendorf PCR扩增仪上完成。PCR反应总体积为20 μL，包括1.5 μL基因组DNA 40 ng，2.0 μL引物(20 mmol·L-1)，2.0 mL 10×PCR缓冲液(含Mg2+)，2.0 μL底物dNTPs(2.5 mmol·L-1)，1.0 μLTaq酶(2 U·μL-1)和11.5 μL ddH2O。

ISSR-PCR 扩增程序为：94℃ 5 min，47个循环(94℃ 30 s，51℃ 45 s，72℃ 1.5 min)，最后72℃ 5 min。扩增产物用1.8%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，并在紫外凝胶成像系统上保存分析，同时为了保证试验的准确性，每个ISSR反应重复2次以上(表2)。

表1　供试材料基本信息

表2研究所用ISSR引物序列及退火温度

Table 2Sequence and annealing temperature for ISSR primers used on alfalfa

1.4数据统计及分析

以0、1、9统计ISSR扩增带型，在相同迁移率位置上，有带记为“1”，无带记为“0”，缺失记为“9”，并建立分子数据矩阵。利用NTSYS-pc2.10软件通过非加权平均法(UPMGA)计算苜蓿种质间的遗传相似系数，并在此基础上作聚类分析及主成分分析。采用POPGEN32软件估算ISSR标记的主要遗传多样性参数，包括引物扩增总条带数(TNB)、多态性条带数(NPB)、多态性条带百分比(PPB)、有效等位基因数(Ne)、Nei′s基因多样性指数(H)、Shannon′s信息指数(I)和多态性信息含量(PIC)。

2　结果与分析

2.1苜蓿种质ISSR多态性分析

从33个ISSR引物中筛选出多态性丰富、稳定性好的引物共12个，引物筛选率为36.36%。利用筛选出的12个ISSR引物对供试苜蓿种质进行了检测分析，不同引物的表现情况详见表3。从表上可以看出，不同ISSR引物对苜蓿基因组的扩增存在较大差异。在扩增条带衡量指标方面，单个ISSR引物扩增条带数分布在3～9个，平均为5.92个；多态性条带数也分布在3～9个，平均为5.75个；引物多态性条带百分率表现良好，其分布范围为75%～100%，除ISSR14和ISSR31外，其余ISSR引物的多态性条带百分率均为100%，多态性条带百分率平均达到了96.25%。不同ISSR标记间的遗传参数表现差异也较大。有效等位基因数分布在1.31～1.74，平均为1.50；Nei′s基因多样性指数的分布范围是0.21～0.42，平均为0.30；所有引物的Shannon′s信息指数都较高，其分布范围在0.34～0.55，平均为0.46。多态性信息含量是衡量分子标记有效性的重要指标之一，从表上不难看出，不同ISSR标记的多态性信息含量差异较大，其分布范围介于0.19～0.41，平均为0.33。

表3　苜蓿ISSR标记遗传多样性参数

2.2不同苜蓿种质亲缘关系分析

基于ISSR检测数据获得了苜蓿种质间的遗传相似系数，具体详见表4。从表上可以看出，不同苜蓿种质间遗传相似系数差异较大，遗传相似系数分布在0.296～0.887，其中苜蓿种质08432与种质08440间的遗传相似系数最小，而种质00399与种质00038间的遗传相似系数最大，这表明，与其他苜蓿种质相比，种质08432与种质08440间的亲缘关系最远，而种质00399与种质00038间亲缘关系最近。同时可以看出，所有苜蓿种质平均遗传相似系数为0.617，表明供试苜蓿种质整体遗传差异水平较高，其在未来苜蓿遗传育种相关研究中具有较好的利用效果。

表4　不同苜蓿种质间的遗传相似系数

2.3不同苜蓿种质聚类分析

以ISSR标记检测为基础对19份苜蓿种质进行了聚类分析，具体结果详见图1。从图上可知，19份苜蓿种质在遗传系数0.526处可被划分为两大类，第1类群包括的苜蓿种质数最多，达到了17个，占到所有供试苜蓿种质总数的89.47%，其中国内苜蓿种质12个，国外苜蓿种质5个；第2类群包含的苜蓿种质数只有2个，均来自国内，分别是0844 0和0844 6。根据第1类群中苜蓿种质的亲缘关系的远近，该类群在遗传相似系数0.636处又可划分为两个亚群，第1亚群共包括6个苜蓿种质，其中3个国外种质，3个国内种质，第2亚群也由11个苜蓿种质构成，除5S43和三得利外，其余均为国内苜蓿种质。

2.4苜蓿种质主成分分析

以ISSR标记检测数据为基础，对19份苜蓿种质进行了主成分分析，具体分析结果见图2。在主成分分析中，前3个主成分能解释的总遗传变异较高，达到了45.50%。从图上可以看出，主成分分析获得了与聚类分析完全一致的结果，聚类分析中被聚为同一类群的苜蓿种质在主成分分析中也被划分为一类，由此可见，主成分分析结果也在一定程度上能够准确反映出不同苜蓿种质间亲缘关系的远近。

3　讨论与结论

3.1苜蓿种质ISSR多样性分析

苜蓿遗传多样性研究是苜蓿种质创新利用和遗传改良的重要基础。本研究利用12个多态性丰富的ISSR引物对19份国内外苜蓿种质进行了研究，共扩增出有效基因位点71个，其中多态性位点69个，多态性百分率为96.25%，该结果与张颖娟等[9]研究存在一定的差异，虽然本研究获得的平均基因位点数较少，但多态性条带百分率要高于后者，这可能与不同研究材料有关。分子标记对苜蓿基因组的扩增效果是开展苜蓿种质遗传多样性分析的重要基础，而分子标记多样性参数是衡量该标记扩增效果的重要指标，虽然前人利用ISSR标记对苜蓿种质已做了部分研究，但对ISSR标记扩增效果的分析主要集中于扩增条带数、多态性条带数和多态性位点百分比[14-15]方面，分析指标较为单一。本研究对利用的12个ISSR标记的7个重要多样性参数进行了较为系统的分析，结果表明，不同ISSR标记的多样性参数表现存在较大差异，所有ISSR标记的有效等位基因数、Nei′s基因多样性指数、Shannon′s信息指数和多态性信息含量平均分别为1.50、0.30、 0.46和0.33，这表明ISSR标记在检测苜蓿遗传多样性方面效果较好，综合比较认为，ISSR1、ISSR9、ISSR15、ISSR32、ISSR33的检测效果相对最好。

3.2苜蓿材料间的亲缘关系分析

苜蓿种质亲缘关系分析是开展苜蓿种质有效利用的重要基础。只有掌握了苜蓿种质间的亲缘关系，我们才能根据不同苜蓿农艺性状的特点进行有效的亲本选配，最终通过对优异杂交后代的选择，培育出适合生产需求的优良苜蓿新品种。本研究通过对19份国内外苜蓿种质遗传多样性的分析，结果发现，供试苜蓿种质平均遗传相似系数为0.617，陈立强等利用SSR标记对41份苜蓿种质遗传多样性作了分析，获得苜蓿种质平均遗传相似系数为0.791，通过比较不难发现，本研究供试苜蓿种质遗传差异性水平较高，其亲缘关系较远。同时，研究发现，苜蓿种质的亲缘关系远近与其所处地理位置相关性不大，来源于地理位置很近的苜蓿种质不一定具有很近的亲缘关系。本研究中亲缘关系最远的2个苜蓿种质均来自国内，即苜蓿种质08432与种质08440，同样的现象也在苜蓿种质聚类分析及主成分分析中也得到了一定的体现，从图1和图2上可以看出，来自国外的苜蓿种质与国内苜蓿种质经常被聚为一类。根据亲缘关系的远近，本研究最终将19份苜蓿种质聚为两大类。苜蓿种质亲缘关系的解析将为苜蓿种质在未来苜蓿育种中的有效利用提供可靠依据，特别是对那些农艺性状优良、亲缘关系较远的苜蓿种质而言，其未来在苜蓿育种中的利用前景尤为广阔。

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(责任编辑：柯文辉)

Genetic Diversity of Nineteen Alfalfa (MedicagoL.)Germplasms Analyzed Using ISSR Markers

WANG Jian-sheng1, HOU Gui-ling1,CHENG Li-ping1，XIE Yong-feng2

(1.PingdingshanUniversity,Pingdingshan，Pingdingshan，He′nan467000,China;2.GrasslandInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalScience,Hohehaote，Neimenggu010010,China)

Genetic diversities of 19 domestic and foreign alfalfa germplasms were analyzed using ISSR markers. A total of 71 effective loci were obtained for the germplasms using 12 ISSR primers, of which 69 loci were polymorphic, i.e., 96.25% of the total. The mean effective number of alleles(Ne), Nei's gene diversity(H), Shannon's information index(I), and polymorphism information content(PIC) were 1.50, 0.30, 0.46, and 0.33, respectively. The genetic similarity coefficients of the alfalfa germplasms ranged from 0.296 to 0.887, averaging 0.617, suggesting ahigh genetic heterogeneityamong the germplasms. According to a cluster analysis, all of the alfalfa germplasms could be divided into 2 groups at the genetic similarity coefficient of 0.522.One group consisted of 17 germplasms, accounting for 89.47% of the total. Another group had 2 alfalfa germplasms only. A same result was obtained by the principal component analysis. The information could be used for identification and effective utilization of the alfalfa germplasms.

alfalfa; genetic diversity; ISSR analysis

2016-01-27初稿；2016-04-06修改稿

王健胜(1978-)，男，讲师，博士，主要从事作物遗传育种研究(E-mail：wjsheng1998@163.com)

河南科技厅科技攻关项目(KJT142102110171)；平顶山市科技计划项目(2014086)

S 541+,102

A

1008-0384(2016)07-708-06

王健胜，侯桂玲，程立平，等.19份苜蓿种质遗传多样性的ISSR分析[J].福建农业学报，2016，31(7)：708-713.

WANG J-S，HOU G-L，XIE Y-F，et al.Genetic Diversity of Nineteen Alfalfa (MedicagoL.)Germplasms Analyzed Using ISSR Markers[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(7)：708-713.